猕猴桃雄株倍性差异与花粉性状的相关性分析
作者：廖光联，陈 璐，钟 敏，王斯妤，黄春辉，陶俊杰，曲雪艳，徐小彪 （江西农业大学农学院，猕猴桃研究所，南昌 330045）
摘 要 以来源于中华猕猴桃和美味猕猴桃的48份雄株为试材，对其倍性及其花粉性状进行差异性检测，并进行聚类分析和相关性分析。结果表明：供试的48份雄株倍性之间具有较大的差异，有2x、4x、6x 3 种倍性类型，其中中华猕猴桃多为低倍性（2x、4x），2x占整个供试中华猕猴桃样品总数的72.09%，变异系数为35.48%，美味猕猴桃均为6x；美味猕猴桃的花药数整体上高于中华猕猴桃，但花粉量和花粉活力整体低于中华猕猴桃。聚类分析表明，供试的48份雄株可分为4大类：Ⅰ类群花粉量变化幅度最大，所有样品每朵花花粉量为6000～8000粒；Ⅱ类群花药数最多且变化幅度最大，最大花药数与最小花药数样品均在此类群中，同时该类群还包含2x、4x、6x 3种类型倍性；Ⅲ类群花粉活力最高；Ⅳ类群花粉量最高且均为2x，花药数与花粉活力变化幅度最小。相关性分析表明，雄株倍性与花药数之间呈极显著正相关，其皮尔逊相关系数为 0.811。
▲一株种植在蒲江佳沃果园猕猴桃公树
Ploidy difference and correlation analysis of pollen traits from male plants in Actinidia
Abstract： Forty-eight male plants of Actinidia chinensis and A. deliciosa which collected previously were used as experimental materials in this study. The differences in ploidy and pollen traits were detected, and the cluster analysis and correlation analysis were also carried out. The results showed that there is a big difference between the forty-eight male plants of A. chinensis and A. deliciosa, which have 2x, 4x, 6x three ploidy types. The ploidy of most of the the A. chinensis is 2x and 4x, and 72.09% of the A. chinensis is 2x, with the coefficient of variation is 35.48%. For A. deliciosa, all type of ploidy are 6x. The anther number of the A. deliciosa is higher than that of A. chinensis, while the pollen viability and pollen count of the A. deliciosa is lower than that of A. chinensis. By means of the cluster analysis, the forty-eight male plants can be divided into four major categories, of which the first category has the biggest rang of pollen count, the pollen content of all samples was concentrated within 6 000~8 000 grains. The second category has largest anther number and the biggest rang of it. The category contain the largest and the lowest anther number of sample, as the same time the three level of ploidy (2x、4x、6x) are in it. The pollen viability of the third category is the most highest and all the samples of the fourth categories are diploid, the rang of the anther number and pollen viability are smallest. Correlation analysis showed that there is a significant correlation between ploidy and anther number with the Pearson correlation coefficient is 0.811.
▲红心猕猴桃雌花
猕猴桃（Actinidia spp.）是雌雄异株的藤蔓型果树，生产中往往需要配置相应的授粉雄株，充分的授粉将决定坐果率、果实品质、产量等很多方面，并且同种花粉对不同雌株授粉时存在花粉直感效应，这与坐果率密切相关，选择最适合的授粉雄株对猕猴桃坐果率影响极大。目前猕猴桃以露地种植为主，在生产上往往因花期不遇、下雨等恶劣天气导致雌株授粉不良，产量及果实品质下降，仅依靠天然授粉猕猴桃很难获得优质高产，采用人工辅助授粉显得尤为必要，研究表明人工授粉的坐果率明显高于自然授粉。
▲猕猴桃电动授粉枪授粉
江西省奉新县是江西最早开始种植猕猴桃的集中区域，在长期的生产栽培过程中，不断发掘当地野生猕猴桃雄株的同时也不断引进外来雄株进行授粉，因此该地区雄株品种丰富，存在着同物异名、同名异物等现象。并且各雄株花粉性状表现参差不齐，对人工制粉、授粉造成严重的干扰，急需对当地猕猴桃授粉雄株进行分子鉴定和分类以及筛选出花粉量大、花粉活力高的配套雄株，以达到猕猴桃高产稳产的目的。据此，本试验拟以项目组前期收集的 48 份猕猴桃雄株为试验材料，测定其倍性、花药数、花粉量、花粉活力并进行聚类和相关性分析研究，探究其花粉特性，以期为筛选不同花期的优良配套授粉雄株提供理论依据和材料基础。
▲江西奉新猕猴桃
1 材料与方法
1.1 试验材料
以项目组前期收集的来源于中华猕猴桃和美味猕猴桃的 48 份雄株为试验材料，参照杨红等的方法，每份材料各采集 1～3 片幼叶和大蕾期花苞 20 朵，放于自封袋中并做好标记，迅速放入冰盒并运回实验室处理。
1.2 试验方法
1.2.1 雄株倍性测定
取约0.5cm2样品幼叶放于平面载玻片上，加入400μL 萃取液，使用尖锐的刀片用力横切样品，并浸泡2～5 min，之后将样品以及液体用过滤网过滤到样品管中，再加入1600μL的DAPI 染液，避光染色2～5min 后，利用 CyFlow Cube 流式细胞仪进行倍性检测。在测定样品前，先以已知倍性的‘红阳’（2x）及‘金艳’（4x）为标样，设定好电压、流速等相关指标后开始测定样品倍性。
▲猕猴桃雄花
1.2.2 花药数量的记录
随机选取10个大蕾期花苞，用镊子将其花药剥离于A4 纸上，清点其花药数量并记录。
1.2.3 花粉量的测定
参照沈根华等的方法，随机选取50粒花药于2mL离心管中，重复3次，置于28 ℃恒温箱中24h使其花粉完全散开，加入200g/L六偏磷酸钠2mL，在旋涡振荡仪上振荡成悬浮液，选取400μL于2mL离心管中，再加入1600 μL 六偏磷酸钠，摇匀，使用血小球计数板，置于显微镜下观察并统计其花粉粒数。
▲江西奉新猕猴桃
1.2.4 花粉活力的测定
使用体外萌发法，参照齐秀娟等[8]方法并改良，最适固体培养基为10%蔗糖+100mg/L 硼酸+10mg/L 硝酸钙+0.8%琼脂粉。将所有的花药剥离后，包在A4纸中，置于28 ℃恒温箱中烘24h，使花粉自然散出。用毛笔蘸取少量烘制好的花粉，均匀撒在滴有培养基的载玻片上，并置于铺好湿润滤纸的培养皿中，在28 ℃下培养3.5h后用显微镜观察，统计其萌发率。花粉是否萌发以花粉管长度超过花粉粒直径作为依据，每份材料做3组载玻片，每载玻片选取2个视野进行统计，每个视野花粉粒数为50～80粒。
1.2.5 数据处理
利用 SPSS Statistics17.0 软件对雄株倍性、花药数、花粉量、花粉活力进行相关性分析。使用NTSYSpc 2.10e 软件进行不同雄株花药数、花粉量、花粉活力的聚类分析。
▲猕猴桃雄株倍性差异与花粉性状的相关性分析
2 结果与分析
2.1 不同雄株倍性、花药数、花粉量、花粉活力分析
如表 1 所示，供试的 48 份雄株倍性有 2x、4x、6x 3 种类型，其中，中华猕猴桃多为低倍性（2x、4x），2x 占整个供试中华猕猴桃样品总数的 72.09%，变异系数为 35.48%，美味猕猴桃均为 6x；每朵花花药数为 30～193 粒，47号雄株最多，38 号雄株最少；每花药花粉量为 1 000～23 000 个，22 号雄株最多，4、10、13、43 号雄株最少；花粉活力为11.06%～81.40%，43号雄株最高，29号雄株最低。
其中，中华猕猴桃雄株每朵花花药数为30～90粒，平均为55粒；每花药花粉量为1000～23000 粒，平均 7884粒；花粉活力为 11.06%～81.40%，平均花粉活力为 51.62%，变化幅度均较大。美味猕猴桃雄株每朵花花药数为142～193粒，平均为163粒；每花药花粉量为3000～5000 粒，平均为 4 000 粒；花粉活力为 32.67%～53.17%，平均为46.31%，变化幅度均较小。由此可见，美味猕猴桃的花药数整体上高于中华猕猴桃，但花粉量和花粉活力整体上低于中华猕猴桃。
▲国内培育的优质猕猴桃雄花
2.2 不同雄株的倍性、花药数、花粉活力相关性分析
利用 SPSS Statistics17.0 软件对不同雄株的倍性、花药数、花粉活力进行相关性分析，结果表明，倍性与花药数呈极显著正相关，皮尔逊相关系数为0.811，其他指标间相关性均不显著（表 2）。
对不同雄株的倍性、花药数、花粉量、花粉活力进行聚类分析，结果如图1所示，以遗传相似系数 1 803.16 为界，将 48 份样品分成 4 大类。其中Ⅰ类群有12个单株，其花粉量变化幅度最大，每花药花粉量集中在 6 000～8 000 粒；Ⅱ类群有 20个单株，其平均花药数最多且变化幅度最大，最大花药数与最小花药数样品均在此类群中，同时该类群包含了 2x、4x、6x ３种类型倍性植株；Ⅲ类群有13 个单株，平均花粉活力最高；Ⅳ类群有 3 个单株，平均花粉量最高且均为2x倍性，花药数与花粉活力变化幅度最小。结合 4大类群的聚类特征可筛选出7份花粉活力大于60%、每朵花花药数多于50粒、每花药花粉量大于6000 粒的单株，即 18、19、22、31、34、40、42 号雄株。
▲猕猴桃雄株倍性差异与花粉性状的相关性分析
由表3可知，花药数、花粉量以及花粉活力在4大类群中的变异系数变化幅度均较大，这表明猕猴桃花药数、花粉量及花粉活力具有遗传多样性。其中，II 类群的花药数、花粉量及花粉活力离散程度高于其他 3 个类群，说明花药数、花粉量及花粉活力在 II 类群中具有丰富的遗传多样性。美味猕猴桃雄株花药数、花粉量、花粉活力的变异系数均低于中华猕猴桃雄株。
▲猕猴桃雄株倍性差异与花粉性状的相关性分析
3 结论与讨论
猕猴桃花期较短，如遇低温多雨，不仅会影响花粉的正常发育，还会抑制花粉的传播，进而影响坐果率和产量，所以常需要进行人工授粉来提高坐果率。人工授粉的关键在于花粉本身与授粉方式，不同的授粉方式对坐果率有决定性的影响。
不同倍性的雄株对猕猴桃的坐果状况及果实单果重、果肉颜色、种子千粒重等性状具有显著影响。曾华等研究发现，中华猕猴桃存在 2x 和 4x 2种倍性水平，美味猕猴桃存在 4x、5x、6x 3 种倍性水平。本研究结果表明，供试的中华猕猴桃多为低倍性（2x、4x），2x倍性的雄株居多，美味猕猴桃则均为6x，并没有 4x、5x 倍性水平的样品，这与采集样品具有直接关系。在供试样品中，中华猕猴桃雄株倍性变异系数为 35.48%，可见中华猕猴桃的倍性水平具有较高的遗传多样性。
▲猕猴桃雄株倍性差异与花粉性状的相关性分析
供试的48份猕猴桃雄株每朵花花药数最多为193粒，最少为30粒，由此可见在同一种内不同品种间差异较大，在小麦上的研究发现不同基因型小麦花药培养特性差异也较大。叶正文等研究表明，每花药花粉量与品种特性、树体营养以及当年气候条件、栽培管理措施等外界条件有关，但与品种的关系最为密切。吴振玲等研究表明，春季前期积温的高低对花粉量有决定性的影响。本研究结果表明，48份猕猴桃雄株每朵花花粉量最高的为23000粒，最低为1000粒，差异也较大。考虑到猕猴桃新鲜花粉活力最高和环境对花粉活力的影响，本试验全采用新鲜花粉进行测定，结果显示48份不同雄株中花粉活力最高为81.40%，最低为11.09%，参照沈根华等活力低于30%不宜选作授粉雄株，供试样品中花粉活力低于30%的达16.67%。总体来看，花药数、花粉量、花粉活力在同一种内不同品种间存在较大的差异性，其中中华猕猴桃雄株花粉量和花粉活力整体上高于美味猕猴桃，花药数则整体低于美味猕猴桃雄株，该结果与齐秀娟等研究结果基本一致。同时在桃、枣、苹果、山楂、梨、杏上的研究也表明，同一物种但不同品种间花粉量以及花粉活力差异较大。
▲贵州猕猴桃花粉
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