猕猴桃花粉贮藏方法比较D
作者：陈馨月，苟晓蝶，单真交，王 蓉，彭言劼，潘自辉，陈小溪
(1.乐山师范学院生命科学学院乐山614000;2.峨眉山生物多样性保护与利用研究所乐山614000;3.大渡河流域特色水果博士工作站乐山614904;4.湖北省林业调查规划院武汉 430079;5.襄阳市林业科学技术推广站襄阳441022)
▲低温储藏花粉，使用前分装猕猴桃花粉
摘 要: 为了提高猕猴桃花粉的贮藏水平，保障其贮藏后的生活力，以猕猴桃雄株品种‘海沃德’的花粉为试材，采用了花粉萌发测定法，比较分析猕猴桃花粉生活力在不同干燥方式及贮藏条件下的差异。结果表明：阴干干燥法所制备的猕猴桃花粉生活力最高，达到了45.85%，烘干干燥法所制备的猕猴桃花粉生活力最低，只有19.45%。
▲猕猴桃雌花、猕猴桃雄花
-20℃低温贮藏条件能大大延长猕猴桃花粉的生活力，贮藏11月后花粉活力仍能保持在16.58%。贮藏环境有无光照、是否放置硅胶对猕猴桃花粉生活力均无显著性影响。该研究结果对于猕猴桃花粉贮藏技术的选择具有重要参考意义。
关键词：猕猴桃，花粉生活力，干燥方式，贮藏方法
▲猕猴桃花粉活性检测
Comparison of Different Strategies for Pollen Storage of Actinidia chinensis
Chen Xinyue(”)Gou Xiaodie"Dan Zhenjiao(1)Wang Rong(”)Peng Yanjie(1.2,3) Pan Zihui4)Chen Xiaoxi (5)
(1. College of Life Sciences,Leshan Normal University Leshan 614000;
2. Institution of Biodiversity Conservation and Utilization in Emei Mountain Leshan 614000;
3. Doctor Research Center of Local Fruits on Dadu River ValleyLeshan 614904;
4.Hubei Provincial Forestry Investigation and Planning Institute Wuhan 430079;
5. Xiangyang Forestry Science and Technology Extending StationXiangyang441022)
Abstract:To improve storage quality of Actinidia chinensis pollen and to guarantee its viability after storage, pollen from male varieties ‘Hayward’of A. chinensis was used as test material for comparative analysis of the differences in the viability under various drying methods and storage conditions via the pollen germination assay. The results showed that findings demonstrated that dryness in the shade produced the most viable A. chinensis pollen,reached 45. 85% , while the ovendrying method produced the least viable pollen (19.45%). The A. chinensis pollen's vitality was considerably prolonged by the low-temperature storage settings at -20℃ and stayed at 16.58% after ll months of storage. The vitality of A. chinensis pollen was unaffected significantly by the storage environment with or without light and silica gel. The results of this study have important reference implications for the selection of pollen storage techniques for A. chinensis.
Key words: Actinidia chinensis ;pollen viability; drying methods;storage methods
▲猕猴桃花粉放入冰箱低温保存
猕猴桃Actinidia chinensis属猕猴桃科猕猴桃属植物，分布在中国、日本、朝鲜以及欧亚大陆的温带地区，具有丰富的营养价值。猕猴桃果实可食用，由于其清香鲜美，经济、医疗效果好而广受关注。猕猴桃为雌雄异株植物，雌株为果实型，雄株为传粉型。在自然条件下，猕猴桃以昆虫和风媒授粉为主，但开花时间短、雌雄比例不当、恶劣天气等因素容易导致猕猴桃雌株出现授粉、受精不良的情况，而正常的授粉、受精是猕猴桃雌株正常结实的先决条件，也是其优质高产的基础。为解决猕猴桃在雌花和雄花之间花期不遇和传粉率低的难题，在生产中常采用人工授粉技术，以达到授粉的目的。在同一个果园中，同一品种的猕猴桃雄花通常要比雌花提前2~3d开花，而猕猴桃的花期又非常短暂，最短的只有3~5d，如果错失了传粉的时机会影响一整年的收获。因此，提前采集猕猴桃的花粉，并进行人工辅助传粉是最常用的方法。
▲猕猴桃花粉运输过程中需要低温加冰袋
花粉的活性受干燥方式和贮藏条件的影响较大，在常温下，储存时间对花粉的生活力有着很大影响，花粉生活力会随储存时间的增加而急剧降低。但是，如果干燥方式及储藏条件适宜，则可以显著延长花粉的生命。如何保存猕猴桃花粉能够使猕猴桃花粉长期保持活力成为亟待解决的问题。‘海沃德’是四川地区主要栽培猕猴桃雄株品种，本试验采用‘海沃德’猕猴桃雄株作为试材，通过比较不同干燥方式以及贮藏条件，研究花粉生活力的变化，以获得最佳的干燥和贮藏效果，进而为生产实践中花粉贮藏提供依据，提高授粉效果。
▲猕猴桃花粉使用之前建议放到潮湿环境醒粉
1 材料与方法
1.1试验地概况
试验地点位于四川省乐山市乐山师范学院峨眉山生物多样性保护与利用研究所，东经103°45'，北纬 29°33'，海拔376.9m，属亚热带季风气候，常年平均温度 13~21℃。
1.2 试验材料
试验主要材料为‘海沃德’猕猴桃雄株花粉。猕猴桃花朵于2021年5月17日采集于5a生海沃德雄株，采集地点位于都江堰虹口乡，属中亚热带湿润气候区，常年气温在14~21℃之间。猕猴桃园土壤类型为山地黄壤，pH值6.2。
1.3 试验方法
1.3.1 花粉的干燥方法
将花药分为4份，分别通过阴干干燥法、摇床干燥法、烘干干燥法、真空干燥法进行干燥处理(表1)。经过干燥后，将洁净的玻璃瓶压在花药上，用手轻轻按压，让花药中的花粉被释放出来。接着，将释放出的花粉置于光滑纸面，用手指轻轻敲击纸面，将花粉与花药碎片等杂质完全分离开来。收集不同干燥处理下的猕猴桃花粉，装入对应离心管中，并及时进行花粉生活力测定，比较不同干燥方式对猕猴桃花粉生活力的影响。
▲猕猴桃花粉贮藏方法比较
1.3.2 花粉的贮藏条件及贮藏时间
将经过不同干燥方法处理的猕猴桃花粉分别放置于200uL PCR 管中，并用封口膜封口，以保证密封贮藏环境，将其分别以6种不同贮藏方法储藏(表 2)。每隔30d随机选取PCR管，对猕猴桃花粉生活力进行测定，每个处理5个重复，共贮藏11个月，探究猕猴桃花粉的贮藏条件及贮藏时间对其生活力的影响。
▲猕猴桃花粉贮藏方法比较
1.3.3 花粉生活力测定方法
花粉生活力测定采用花粉萌发测定法，配制配方为10%蔗糖+0.01%硼酸+0.001%硝酸钙的培养液，用于花粉萌发培养。将不同处理下的装有花粉的PCR管(花粉占 PCR管体积的 1/20)在室温下放置30min后开盖，以达到自然解冻的效果。花粉复苏后，将培养液于26℃的恒温金属浴中加热10min，使用移液枪吸取200μL培养液至装有花粉的PCR管中，再使用小型离心机使每管的花粉沉底。以剪口枪头吸取底部花粉混合液至提前标记好的2mL离心管中，再吸取80uL培养液至装有混合液的2mL离心管中，将花粉及培养液吹打混匀。将装有混合液的2mL离心管放入26 ℃、200 rpm的摇床中培养6h。吹打混匀后吸取50μL混合液至洁净载玻片上，用盖玻片盖好后置于光学显微镜10倍目镜、40倍物镜下观察花粉的萌发情况。每个处理随机选择5管花粉，每管随机选取1个至少有10粒花粉的视野进行观察，以花粉管长度超过花粉粒直径1/2的花粉为萌发花粉，对视野中的花粉萌发数及花粉总数进行记录，最终对5个视野花粉萌发率进行计算，取其平均值作为该处理的萌发率。
花粉生活力(%)=视野中萌发花粉数/视野中花粉总数X100%。
▲优质的猕猴桃花蕾
1.4 数据处理与分析
结果数据以平均值士标准误表示。使用Excel2019进行数据处理，使用SPSS25进行数据分析，使用 Origin 2022、GraphPad Prism9作图。
2 结果与分析
2.1 不同干燥方式对猕猴桃花粉生活力的影响
试验结果表明，不同干燥方式对猕猴桃花粉生活力有着不同的影响(ANOVA,p<0.01)。阴干干燥法所得的花粉生活力显著高于摇床干燥法、烘干干燥法、真空干燥法所得的花粉生活力(表3)，其余干燥方式所得花粉生活力之间并无显著差异，但烘干干燥法的花粉生活力最低。
▲猕猴桃花粉贮藏方法比较
2.2 不同贮藏温度和时间对猕猴桃花粉生活力的影响
根据干燥效果，将阴干干燥的猕猴桃花粉用于探究不同储存条件及储存时间对猕猴桃花粉生活力影响的材料。在阴干干燥条件下，贮藏温度对花粉生活力有显著性影响(ANOVA,p<0.01)。贮藏11月后，花粉生活力在-20℃条件下保存效果最好(16.58%)，其次为-80℃(12.68%)，4℃及常温条件下猕猴桃花粉萌发率均为0。常温条件下贮藏的花粉生活力下降迅速，于第4个月全部失去活力；与常温条件下贮藏相比，4℃条件下贮藏的花粉生活力失去活力速度总体相对较缓，0~1个月下降迅速，下降了 27.24%，第5个月时花粉生活力为3.06%，5个月后花粉材料丢失，但因花粉活力很低，不影响后续试验结果；-20℃条件下贮藏的猕猴桃花粉生活力在0~7个月间变化缓慢，7个月后下降迅速，7~8个月时下降了29.10%，此后保持在一定范围内变化，第11个月时花粉生活力为16.58%；-80℃条件下贮藏的猕猴桃花粉生活力在0~3个月时下降较缓，第3~6月下降速度较快，下降了18.56%，在10个月时花粉生活力仍能保持在30.47%，第10个月后下降迅速，10~11个月下降了17.79%。此外，贮藏时间对猕猴桃花粉生活力也存在显著性影响(ANOVA,p<0.01)。猕猴桃花粉生活力随时间的延长而逐渐降低(图 1)。
▲猕猴桃花粉贮藏方法比较
2.3 干燥方式及贮藏温度对猕猴桃花粉生活力的综合影响
不同干燥方式在不同保存温度的条件下保存11个月后，花粉生活力有所差异(图2)。花粉生活力强弱表现为-20℃阴干(16.58%)最优，其次依次为-80℃阴干(12.68%)、-80℃真空(1.71%)、-20℃摇床(1.05%)、-20℃真空(0.91%)，其余均为0。干燥方式为阴干时，-20℃贮藏下的花粉生活力(LSD,p<0.05)显著高于常温、4℃、-80℃，-80℃贮藏下的花粉生活力(LSD,p<0.05)也显著高于常温、4℃。其余干燥方式下各温度之间花粉生活力无显著差异。
2.4 光照对猕猴桃花粉贮藏的影响 在干燥方式为阴干、贮藏温度为4℃的条件下，光照的有无对猕猴桃花粉生活力无显著性影响(ANOVA,p>0.05)。二者均在贮藏1月时花粉生活力下降迅速，避光条件下下降了27.24%，光照条件下下降了25.77%，之后下降缓慢，活力保持在较低水平。第5个月时，避光条件下猕猴桃花粉生活力降至3.06%，光照条件下猕猴桃花粉生活力降至5.08%(图 3)。
2.5 硅胶对猕猴桃花粉贮藏的影响
在干燥方式为阴干、贮藏温度为-20℃的条件下，硅胶的有无对猕猴桃花粉生活力无显著性影响(ANOVA,p>0.05)。在无硅胶的贮藏条件下，猕猴桃花粉生活力在0~7个月变化较缓，7~8个月下降迅速，下降了29.10%；8~11个月变化较缓，花粉生活力在一定范围内波动；11个月时花粉生活力保持在16.58%。在-20℃阴干有硅胶的贮藏条件下，猕猴桃花粉生活力在0~5个月变化缓慢，5~6个月花粉生活力下降较为迅速，下降了17.46%，之后花粉生活力在一定范围内变化，11 个月时花粉生活力仍能保持在20.65%(图4)。
▲猕猴桃花粉贮藏方法比较
3 讨论
猕猴桃的花期很短，而且花粉的活性很大程度上受温度及湿度的影响。在开花期间，如果遇到了寒冷或者是多雨的天气，会对花粉的正常生长和传播产生不利的影响，并且猕猴桃园中的猕猴桃雌雄株可能不是同一品种，花期很可能不遇，这些情况都容易导致猕猴桃错失最佳的传粉期，从而对坐果率和产量产生不利的影响。进行花粉贮藏以及人工辅助授粉可有效提高授粉成效，花粉干燥方式和贮藏条件对花粉生活力的保持有着重要影响，因此，选择适宜的干燥方式及贮藏条件贮藏花粉显得尤为重要。
花粉采集后的干燥方式对花粉生活力的影响至关重要，它会直接影响花粉的活性，因此在花粉处理过程中，应该选择合适的干燥方式，以保证其活力。姚春潮等认为，干燥速度越快，花粉生活力越高，恒温干燥条件下，所得花粉生活力优于阴干干燥。杨红等认为，经阴干干燥法干燥的花粉活性，因区域及环境的不同而有差异。本研究采用的方法中，阴干干燥后猕猴桃花粉生活力最高，真空干燥优于摇床干燥，而烘干干燥最差。已有研究中最长烘干时间为8h，而本试验烘干干燥了12h，可能是由于干燥时间过长，导致花粉失活严重。
▲猕猴桃花粉储藏和运输过程需要低温
收集花粉后如何贮藏是关于猕猴桃研究的热点问题，也是本试验重点研究的问题。已有研究表明，贮存温度对花粉的活性有很大的影响，在低温下，花粉的保存效果会更好，花粉生活力会更高。本试验结果表明，猕猴桃花粉采集并干燥后，四种贮藏温度中，常温贮藏的猕猴桃花粉失去活力最为迅速，在需长期保存时不予采用。4℃可用于短期贮藏，贮藏时间最好在一个月之内。资料显示，如果要长期贮藏，在超低温贮藏的条件下能保持最高花粉生活力，但本研究中，采用-80℃贮藏的效果不如-20℃，可能是由于超低温贮藏需要较好的解冻技术，而解冻过程的质量正是影响花粉生活力的重要原因之一。在后续研究中，可对解冻技术进行深入探究，以判断是否为解冻影响了本研究中的花粉生活力。
▲testing pollen
除贮藏温度，本研究还对贮藏时光照和硅胶对花粉生活力的影响进行了研究。研究结果表明，光照的有无对猕猴桃花粉生活力没有显著性影响，此结论与张洪伟等一致。因此，贮藏猕猴桃花粉时无须刻意遮光。张全锋等认为，花粉放置于干燥环境中，活力下降速度变慢。本试验研究结果得出，硅胶的有无对猕猴桃花粉生活力没有显著性影响，可能是由于本试验各处理均为密封贮藏，导致有无硅胶对猕猴桃花粉贮藏影响不大。在后续研究中，可进一步探究在非密闭环境下，硅胶对猕猴桃花粉活力的影响。
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4 结论
在乐山地区进行猕猴桃花粉贮藏时，采集花粉后宜选择阴干干燥法进行干燥，以保持较高的花粉生活力。猕猴桃花粉最适合的贮藏条件为低温保存，贮藏温度为-20℃和-80℃时，能保证较高的花粉生活力，但-80℃需要适合的解冻和复苏技术，相比之下，-20℃在保障贮藏效果的情况下更加简便易行。本研究的结果也能为其他地区的猕猴桃花粉贮藏提供依据，可在猕猴桃花粉贮藏中推广应用。
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