猕猴桃花粉活力测定条件的优化研究A
作者：徐达，王梦钦，董云龙，张云峰(云南师范大学生命科学学院 云南生物能源持续开发利用教育部工程中心)
摘要：人工辅助授粉是猕猴桃优产高效栽培的重要保障之一，而花粉质量是其中最为重要的限制因素。本研究以不同电商平台销售的猕猴桃花粉为材料，基于正交试验、响应面试验设计对TTC法测定猕猴桃花粉活力的条件进行优化，同时对萌发率、授果率与花粉活力进行相关性分析。结果表明，不同电商销售的花粉在花粉数量、花粉活力、萌发率及坐果率上均存在较大差异；TTC法检验猕猴桃花粉活力的最佳条件为TTC浓度、染色温度、染色时间分别为0.7%、30℃、25min；花粉萌发最佳条件为0.2%硼酸、15%蔗糖；在猕猴桃人工授粉过程中，花粉萌发率与坐果率的相关性最高，而花粉活力与萌发率并非完全一致；部分电商平台销售花粉的花粉活力低、坐果率低。因此，在互联网背景下，涉及农业生产的相关产品应加强管理。
关键词：猕猴桃，花粉量，花粉活力，离体萌发，响应面分析
▲猕猴桃雌花、猕猴桃雄花
Study on the Condition Optimization for Pollen Vitality Test of Kiwifruit
Abstract: Artificial supplementary pollination is one of the important technical guarantees for efficient cultivation of kiwifruit, and the pollen quality is the top limiting factor for artificial pollination during the cultivation. Based on the orthogonal experiment and the response surface design, the condition optimization for pollen vitality test with TTC staining was studied with differential pollen samples of kiwifruit purchased from ecommerce platforms. Meanwhile, the correlations of pollen vitality with in vitro germination rate of pollen and fruit setting rate were analyzed. The results showed that the pollen amount, pollen vigor, germination rate and fruit setting rate had obvious differences among the pollen samples. The best condition for TTC staining test of kiwifruit pollen vitality was TTC concentration of 0.7%, dyeing temperature of 30℃, and dyeing time of 25 min. The optimum condition for pollen germination was boric acid of 0.2% and sucrose content of 15%. The results also showed that the pollen germination rate and fruit setting rate had high correlation during artificial pollination, but the pollen vitality and the germination rate was not well consistent. And some pollen samples bought from e-commerce platforms had low pollen vitality and low fruit setting rate. Therefore, the on-line business of agricultural production materials should be well managed and supervised.
Keywords: kiwifruit; pollen amount; pollen vitality; in vitro germination; response surface analysis
▲testing pollen
引言
猕猴桃也称奇异果，为猕猴桃科猕猴桃属的植物果实。全世界共发现66个种、约118个分类单元，其中中国有62个种，猕猴桃资源极为丰富。1904年新西兰从中国引种猕猴桃，随后选育出多个优良品种(系)。经100多年的发展，猕猴桃不仅成为目前全世界野生驯化最为成功的水果之一，也成为品种多样程度高、世界流行水果之一。《中国猕猴桃产业发展报告(2020)》的数据显示，猕猴桃的栽培已广布于世界5大洲23个国家和地区，截至2020年，全球猕猴桃种植面积达到28万hm，全球猕猴桃产量为451.8万t。中国猕猴桃种植面积达到19.3万hm，产量为229.1万t，无论种植面积还是产量都是稳居世界第一。
▲猕猴桃公花采收
作为雌雄异株植物，猕猴桃的天然授粉坐果率极低，外加雌雄株花期不遇、天气影响等原因致使仅依靠天然授粉很难获得高质优效的栽培效果，人工辅助授粉成为猕猴桃优产高效栽培中极为重要技术手段。山区栽培猕猴桃，由于栽培面积小、栽培分散，猕猴桃栽培果农的花粉或购于电商平台，或由技术合作单位供给。而花粉在采集、保存中受多种因素的影响，其活力、萌发率、授精率都不稳定，给果农的生产带来极大风险。目前对猕猴桃花粉的研究主要集中花粉对果实品质影响、活力测定及其影响因素、花粉培养、花粉散粉规律、花粉萌发与外界环境的关系叫等方面。在花粉质量控制方面，尤其是对电商平台所售花粉的质量评价及采用何种指标有效判定猕猴桃授精情况缺乏研究。本研究以不同电商平台销售的猕猴桃花粉为材料，基于正交试验、响应面试验设计对TTC法测定猕猴桃花粉活力的条件进行优化，对花粉的萌发率、坐果率与花粉活力间的相关性做分析，以期为后续的研究和生产提供指导。
▲猕猴桃花粉活力测定条件的优化研究
1 材料与方法
1.1材料
试验材料为购于电商平台的猕猴桃花粉5份，其中2份由云南建水良丰农业生物技术公司所提供，另外3份由实验室选购。电商平台销售的猕猴桃花粉价格不一、评价差异大、选购次数不同，价格一般在10~30元/g，选购次数可从几次到10万次。为此，选购时按好评优先及购买次数优先的原则进行选购，价格在18~26元/g；同时记录好评数、价格及购买次数。所有花粉样品在试验期间存放于4℃冰箱保存。
1.2 花粉数量检验及TTC染色法活力测定
取10mg花粉样品置于1mL蒸馏水中，混合均匀。随后取1μL混合液置于显微镜下观察花粉细胞数目及活力检验。1μL花粉悬浮液相当于10μg的购买花粉(其中包括辅料)。花粉活力采用TTC染色法进行检验，检验参照张鸿等的方法。为进一步优化活力测定，采用正交和响应面进行设计。在正交设计及响应面设计中采用3因子3水平设计，因子包括 TTC浓度(A,0.3%、0.5%、0.7%)、染色温度(B,20、25、30℃)、染色时间(C,20、25、30min)。
▲恒温震荡气育培养箱检测猕猴桃花粉活性
1.3 离体萌发培养液的优化
在蒸馏水中分别配制蔗糖溶液为5%、10%、15%、20%和硼酸溶液为0.1%、0.15%、0.2%的组合萌发液。将稀释不同倍数的花粉置于花粉萌发液中，随后在温度为(25±2)℃的光照培养箱中培养24h，在显微镜下观察，以花粉管长度大于花粉直径作为花粉萌发的判定标准。
1.4 授粉试验
采用臣风果树电动授粉机进行授粉。选择天气晴朗的8:00-10:00进行授粉。授粉在云南建水良丰农业生物技术公司的猕猴桃栽培基地进行，按说明书将混有辅料的猕猴桃花粉加入授粉器，以点授法对雌花花柱授粉，做好标记，授粉只进行1次，后期以坐果数统计坐果率，坐果率= 坐果数/授粉花朵数x100%
1.5 数据处理
运用Excel、SPSS 26.0和Design Expert 8.0.6对试验数据进行描述统计、差异显著性检验，对花粉活力进行分析。
▲猕猴桃花粉活力测定条件的优化研究
2 结果与分析
2.1 TTC染色花粉活力的正交试验结果
从5份花粉中选取2份由云南建水良丰农业生物技术公司所提供的猕猴桃花粉，对其进行花粉数量、萌发率、花粉活力进行测定，花粉活力的测定条件为TTC浓度0.7%、染色温度25℃、染色时间30min。表1的结果表明，2批猕猴桃花粉在花粉数量、萌发率及花粉活力均存在显著性差异。为优化花粉活力的检验条件，进行正交设计试验(表2)。表2显示TTC浓度、染色温度、染色时间分别为0.7%、30℃、30min(处理7)的花粉活力最高(97%)，而TTC浓度、染色温度、染色时间分别为0.3%、20℃、20min(处理1)的花粉活力最低(22%)。
▲猕猴桃花粉活力测定条件的优化研究
方差分析(表3)显示，TTC浓度、染色温度、染色时间的P值分别为0.021、0.033、0.026，所有P值均小于0.05，表明这些因素对TTC检验花粉活力均有显著性影响。在15%蔗糖、0.15%硼酸、培养时间24h下进行花粉萌发检验(图1)，结果显示2批花粉的萌发率也存在差异，在5、10、24h的萌发率均存在显著性差异，且花粉数量多的样品萌发率并不高。
2.2 TTC 染色花粉活力响应面优化
为进一步优化TTC染色花粉活力检验的条件，基于Design Expert进行试验设计，结果见表4。对响应面设计结果进行统计分析(表5)，模型F=5.75，且P≤0.05，表明模型差异显著。校正决定系数R2=0.7278，相关系数R²=0.8809，表明该模型的拟合度较好，可用于花粉生活力的检验。模型的变异系数为9.6%(<10%)，表明模型稳定性良好，试验操作可靠。模型的信噪比为7.834(>4)，表明该模型能真实地反映试验结果。同时发现，响应面法测定猕猴桃花粉生活力TTC法测定的最佳条件为TTC浓度0.7%、染色温度30℃、染色时间25min，结果与正交试验一致。经回归分析得回归方程，如式(2)。
花粉活力=73.00+10.13A-0.37B+3.00C+7.75AB-4.50AC+1.00BC+6.12A2-8.38B2-10.63C……..(2)式中，A、B、C分别为TTC浓度、染色时间、染色温度。
依回归模型分析，经Design-Expert V8.0.6.1软件对TTC浓度、染色时间及染色温度3个因素进行分析，得到对应的等高线图及响应曲面图(图2)。
在DesignExpert软件分析中，等高线的形态可直观反映出因素间交互作用的大小，圆形表示交互作用小，椭圆形则相反叫，而响应面的坡度变化则可反映出各因素对响应值的影响力，坡度越缓表明影响越小。从图2可看出，TTC浓度、染色时间及染色温度三者间的互作较为复杂，染色温度与TTC浓度的交互作用对响应值影响最大，响应面的倾斜度最高，其次是染色时间与 TTC浓度，最后是染色温度与染色时间。
2.3 花粉离体萌发、授粉及其与活性的相关性
为验证花粉活力与花粉离体萌发、授粉间相关性，选择蔗糖、硼酸溶液对猕猴桃花粉进行离体萌发，蔗糖浓度设定为5%、10%、15%、20%，硼酸浓度为0.1%、0.15%、0.2%，花粉选择活力较高的B公司。结果见图3。蔗糖浓度和硼酸浓度分别为15%、20%，0.15%、0.2%时，猕猴桃的花粉萌发较高，其中15%蔗糖条件下萌发率最高，但在硼酸浓度分别为15%、20%条件下，其萌发率并无显著性差异。因此，可将15%蔗糖、15%硼酸作为猕猴桃花粉的最佳萌发条件。
表6显示，5批花粉虽在花粉数量上差异不显著，但花粉活力、萌发率、坐果率均表现出显著性差异。尤其是坐果率的差异会严重影响到猕猴桃的产量。对花粉活力、萌发率和坐果率之间相关性进行计算，得出花粉活力和萌发率相关系数为0.667，萌发率和坐果率相关系数为0.928，花粉活力和坐果率相关系数为0.843。
因此，坐果率在很大程度上取决于萌发率(表7)。研究表明,利用猕猴桃花粉萌发率显示其花粉活力更为合理，萌发率的测定虽不复杂，但测定时间相对长。同时，将前期电商平台采购时的好评、拼购次数及价格进行排位(表6)，发现已拼次数多、好评排位靠前的花粉，其萌发率、坐果率也较高。因此，在电商平台选购猕猴桃花粉可首先考虑购买次数多、好评优先的产物，其次才考虑价格。
▲packaging kiwi pollen
3 结论与讨论
TTC染色是检测种子活力、花粉活力的常用技术，其原理在于TTC可与活细胞内的琥珀酸脱氢酶产生红色，从而以色泽判断细胞的活力。有研究表明温度对植物花粉的萌发具有重要的影响，因此以此设计正交试验。张鸿等采用TTC法和I2-IK法测定花粉活力，认为TTC和I2-IK不适用于猕猴桃花粉活力的测定，并认为其原因在于猕猴桃花粉内的琥珀酸脱氢酶和淀粉含量较低，不能被染成相应的颜色。本试验的5个样品中，采用TTC测定法所测定的花粉活力在(45±6)%~(90.1±9)%，所有样品都能染色，与张鸿等的结论不一致，因此TTC是否可用于猕猴桃花粉活力的检验也许与品种差异有关。刘成琴等报道TTC对部分植物的花粉染色效果差的原因是花粉壁太厚，染色液无法渗透，而非脱氢酶活性太低。下一步将对不同猕猴桃品种的花粉进行琥珀酸脱氢酶测定，或通过测定不同猕猴桃品种花粉璧的厚度及其对染料的透性进行补充。本试验中，萌发率与坐果率的相关性较高(0.928)，与张鸿等的结果相吻合。从本试验所测的5份购于网络平台的猕猴桃花粉数据来看，虽购于不同平台的猕猴桃花粉，花粉数量上差异不大，但在花粉活力、萌发率、坐果率均存在较大差异。干燥方法、贮藏温度、花粉来源、脱药时间都会影响猕猴桃花粉活力。因此，在互联网背景下，涉及农业生产的相关产品应加强管理，建议相关部分制定法规保障农业生产者的利益。
▲Pollen Collection猕猴桃花采集
花粉离体培养萌发法是检验花粉生活力最直接、有效的方法，离体萌发培养基配制主要由蔗糖、硼等营养成分组成。蔗糖普遍存在于植物体中，不同植物花粉萌发的最佳糖浓度差异大阳。蔗糖能够促进植物花粉萌发和花粉管的生长，并在外部环境中保持渗透压的平衡和稳定。在本研究中，15%蔗糖是花粉萌发和花粉管伸长的最适浓度，这与张鸿等的研究结果有差异。一方面可能与品种相关，另一方面与试验设计的梯度有关，在张鸿等的试验中，其蔗糖浓度从10%直接升到了20%，无15%浓度的设置。硼是影响植物花粉萌发率高低的重要因素，硼离子能和蔗糖形成络合物，增强糖分的吸收与代谢，极大地促进植物花粉萌发，从试验结果可以看出，低浓度的硼酸可能会影响花粉萌发的生长，但硼酸浓度过高也可能产生较高的渗透压，从而影响花粉萌发的生长。
▲Kiwi pollen is tested before sales
本试验中硼的最佳浓度为0.15%，在张鸿等的试验中，硼的最佳浓度为0.1%，其硼设置的也是从0.1%直接升到了0.2%，无0.15%浓度的设置。张伟等3在三角梅花粉萌中发现，不添加蔗糖或硼酸时，花粉萌发和花粉管生长极少，添加适宜硼酸和蔗糖可显著提高花粉萌发和花粉管伸长，表明萌发需要蔗糖和硼酸共同作用。对斐济果的研究表明Ca+浓度是影响花粉萌发的次要因素和花粉管生长的主要因素。Ca+对猕猴桃花粉萌发及花粉管生长的影响需做进一步研究。从本试验看，萌发率均小于坐果率，其原因是否与授粉量相关也需要进一步研究。
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