摘 要：为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性，采用 RT-PCR 对来自四川 6 个地区疑似感染病毒的 90 份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明，22 份样品为 AcV-1 阳性，检出率为 24.4%。将获得的 5 个 AcV-1 分离物和已报道的新西兰分离物 K75 的外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列进行比对，结果表明，分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为 84.8% ~ 97.1%和 89.7% ~99.6%，其中除邛崃分离物 HYH5 与新西兰分离物 K75 的核苷酸序列相似性较高（97.1%）外，其余 4 个分离物均低于 91%。系统进化分析结果显示，这些分离物主要聚集在 3 个分支上，分离物 HYH5 与新西兰分离物 K75 位于同一分支，其余分离物位于另外 2 个分支。
关键词：猕猴桃；猕猴桃病毒 1；RT-PCR；CP 基因；分子特征
四川省是中国猕猴桃优势产区之一，其栽培面积和产量均位居全国前列。目前猕猴桃已成为四川省的优势特色林果类产业（刘强和李晓，2014）。果树病毒病是一种潜伏期长、隐患大的病害，可造成树势衰退、抗病性减弱、果实产量及品质下降等（郝璐 等，2015；任芳 等，2018）。新西兰较早地开展了猕猴桃病毒病的研究工作，其检疫部门在1983年记录了猕猴桃受病毒感染的迹象（Blouin et al.，2013）；随后 Clover 等（2003）从一批处于检疫隔离期的猕猴桃中首次检测到苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV），该病毒在中国和印度的猕猴桃中也均有报道（Bhardwaj et al.，2014；Wang et al.，2017）；Chavan 等（2013）从中华猕猴桃上首次检测到柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）；近期 Blouin 等（2018）采用高通量测序技术鉴定出一种侵染猕猴桃的新病毒，并命名为猕猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1），症状表现为叶片褪绿、黄化，有坏死环斑（Blouin et al.，2018；Peng et al.，2019）。Veerakone 等（2018）在中华猕猴桃中鉴定出一种新的猕猴桃病毒，命名为猕猴桃种传潜伏病毒（Actinidia seed-borne latent virus，ASbLV）。
目前国内外大约有 17 种侵染猕猴桃的病毒被报道（王然 等，2017；Wang et al.，2017； Veerakone et al.，2018）。在中国已鉴定出 8 种能感染猕猴桃的病毒：猕猴桃病毒 A（Actinidia virus A，AcVA）和猕猴桃病毒 B（Actinidia virus B，AcVB）（郑亚洲 等，2015）、柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）（朱晨熹 等，2016）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）（Wang et al.，2017）、猕猴桃褪绿环斑相关病毒（Actinidia chlorotic ringspots-associated virus，AcCRaV）（Zheng et al.，2017）、番茄坏死斑点相关病毒（Tomato necrotic spot associated virus，TNSaV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）（Wang et al.，2016；2018），以及猕猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）（Peng et al.，2019；Wen et al.，2019）。
AcV-1 为长线形病毒科（Closteroviridae）的新成员，基因组为 18 848 nt 的正单链 RNA（+ssRNA），含 12 个开放阅读框（Open reading frame，ORF），主要编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、外壳蛋白（Coat protein，CP）和热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）等（Blouin et al.，2018）。目前在湖北和四川均有 AcV-1 侵染猕猴桃的报道（Wen et al.，2019）。为明确四川地区猕猴桃病毒的发生状况及其分子特性，自 2016 年起开展四川地区猕猴桃病毒病的调查与鉴定工作。在田间调查中发现，采集的猕猴桃症状与已报道的 AcV-1 引起的症状类似。采用 RT-PCR 检测技术，对 AcV-1 猕猴桃分离物的分子变异情况进行分析，以期为该病毒的早期诊断及其分子特征研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2017 年和 2018 年 5—8 月分别从四川省彭州、邛崃、都江堰、蒲江、德阳、广元等地采集‘红阳’‘金果’猕猴桃（Actinidia spp.）疑似感病的叶片样品 90 份（表 1），主要表现出褪绿斑点和黄化两种症状（图 1）。
1.2 引物设计与合成
根据新西兰所报道的 AcV-1 外壳蛋白基因序列（登录号：KX857665）设计扩增引物AcV-1-CP-1F/1R：5′-ATGACTACCAAAGAAACGAA3′/5′-TCAATGATAACCTGAAGT GA-3′，预期扩增片段大小为 732 bp。根据 NCBI 所记载的猕猴桃肌动蛋白基因（Actin 1，ACT1）序列（登录号：EF063572 ）， 利 用 Premier Premier 5.0 设计扩增内参引物 ACT1F/R ： 5′-AATGGTGAAG GCTGGGTTTG-3′/5′-TGAGTGGTGCCTCTGTAAGC-3′，预期扩增片段大小为 287 bp。所用引物均由成都擎科生物技术有限公司合成。
1.3 总 RNA 提取
取猕猴桃病叶 0.1 g 加液氮于研钵中研磨，将粉末转入 1.5 mL 离心管，迅速加入 1 mL 于 65 ℃中预热 20 min 的 CTAB RNA 提取缓冲液（2% CTAB，2% PVP k30，100 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 8.0，1.4 mol · L-1 NaCl，20 mmol · L-1 EDTA，pH 8.0 0.5% β–硫基乙醇），涡旋振荡混匀，65 ℃水浴加热20 min，4 ℃ 12 000 r · min-1 离心 5 min。上清液经酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1）抽提 2 次，4 ℃下12 000 r · min-1 离心 10 min，再加入等体积的 4 mol · L-1 氯化锂，–20 ℃沉淀 4 h。沉淀经 75%乙醇洗涤 1 次，4 ℃ 12 000 r · min-1 离心 5 min，无水乙醇洗涤 1 次，4 ℃ 12 000 r · min-1 离心 5 min，自然干燥，加入 30 μL DEPC 处理水混匀，–80 ℃保存备用。
1.4 RT-PCR
以提取的总 RNA 为模板逆转录合成 cDNA，反应体系为 20 μL。在灭菌的 1.5 mL 离心管中依次加入 dNTPs（2.5 mmol · L-1）4.0 μL，随机引物（10 mmol · L-1）1 μL，RNA 模板 5 μL，DEPC 处理水 4 μL；瞬时离心混匀置于 65 ℃水浴 8 min，冰上静置 2 min。再加入 5 ×反转录缓冲液 4 μL，RNA 酶抑制剂（RNasin，40 U · mL-1）0.5 μL，M-MLV（200 U · mL-1）0.5 μL，DTT 1.0 μL，37 ℃恒温水浴 1 h；70 ℃水浴 15 min 终止反应，并将产物存于–20 ℃保存备用。
PCR 反应总体系为 25 μL：含 2 × Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol · μL-1）各 1 μL，cDNA 2 μL 和 ddH2O 8.5 μL。PCR 反应程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，循环 34 次；72 ℃延伸 5 min。
1.5 扩增产物克隆及序列分析
PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳后，按微量琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书（上海生工）对 PCR 产物进行回收。回收产物连接至 pMD19-T Vector（大连 TaKaRa 公司）后转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞。挑取单菌落，摇菌培养，随机选取 1 ~ 3 个经 PCR 鉴定的阳性克隆，送至成都擎科生物技术公司进行测序验证。采用生物学软件 DNAMAN version 9 和 DNASTAR 完成序列比对；采用MEGA 6.0 软件中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，Bootstrap 重复次数为 1 000。
▲猕猴桃授粉
2 结果与分析
2.1 总 RNA 及 RT-PCR 引物扩增质量检测
以 cDNA 为模板对内参基因进行普通 RT-PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图 2，A）显示，猕猴桃内参基因 ACT1 与预期大小的目的条带一致，且条带单一，无非特异扩增，表明反转录产物可用于后续的病毒检测。以 cDNA 及 AcV-1 阳性质粒为模板对 AcV-1 的 CP 基因进行 RT-PCR 扩增（图 2，B）：在健康植株和空白对照中均无扩增条带产生，病样植株中扩增出的条带与 AcV-1 的阳性质粒大小一致，说明 AcV-1 CP 引物扩增特异性较好。
2.2 AcV-1 在四川猕猴桃主产区的发生情况
利用 RT-PCR 检测 90 份疑似病毒侵染的样品，22 份样品的检测结果为 AcV-1 阳性，总检出率为 24.4%（表 1）。其中，叶片为黄化症状的样品有 14 份，集中在都江堰、邛崃地区；褪绿斑点症状的样品有 3 份，主要分布在彭州和蒲江地区；有 5 份阳性样品，叶片无明显症状。在彭州地区的‘红阳’和‘金果’品种各有 1 株检测到 AcV-1，检出率为 12.5%。在都江堰和邛崃地区‘红阳’品种中 AcV-1 的阳性检出数量分别为 4 株和 6 株；‘金果’品种中 AcV-1 的阳性检出数量分别为 3株和 4 株，这表明同一地区不同品种猕猴桃中均存在 AcV-1 的侵染。都江堰和邛崃两地区的样品中AcV-1 检出率较高，分别为 28.0%和 33.3%。另外，在德阳、广元、蒲江的猕猴桃样品中 AcV-1 检出较少，仅各有 1 株样品检测到 AcV-1。
▲夏天的猕猴桃果园
2.3 AcV-1 分离物 CP 基因核苷酸和编码氨基酸序列分析
将 22 个阳性样品的扩增产物进行克隆测序，序列比对结果显示：都江堰、蒲江的 8 个阳性样品扩增产物的序列完全相同，占阳性样品的 36.4%；彭州地区的 2 个扩增产物序列完全一致，占 9.1%；德阳和广元的 2 个阳性扩增产物序列相同，占 9.1%；邛崃的 10 个阳性样品序列主要分为两类，分别占 9.1%（2 个）和 36.4%（8 个）。
从这些分离物中选择 5 个有代表性的克隆——蒲江分离物 PJ1（登录号 MH557854）、彭州分离物 WB13（MK421388）、邛崃分离物 HYH5（MK421390）和 HYH8（MK421389）、广元分离物 GYH1（MH557856）进行 AcV-1 外壳蛋白基因序列分析。结果（表 2）显示，5 个 AcV-1 分离物间核苷酸和氨基酸序列一致性分别为 84.8% ~ 92.9%和 89.7% ~ 96.7%，其中邛崃地区的 HYH5 和 HYH8 两个分离物间核苷酸和氨基酸序列存在较大的分子差异，其一致性分别为 87.7%和 91.0%。四川地区 AcV-1的5 个分离物与新西兰报道的分离物K75 核苷酸和氨基酸序列一致性分别为87.3% ~ 97.1%和91.4% ~ 99.6%。分离物 HYH5 与新西兰分离物 K75 的核苷酸和氨基酸序列一致性最高，分别为 97.1%和99.6%，分离物 HYH8 与新西兰分离物 K75 的核苷酸和氨基酸序列一致性最低，分别为 87.3%和91.4%。
利用 MEGA6.0 对 5 个分离物和新西兰分离物 K75 的核苷酸和氨基酸构建系统进化树，结果（图3，A、B）显示，分离物 HYH5 与新西兰分离物 K75 聚集在同一进化分支上，其他分离物序列与新西兰分离物 K75 存在一定的遗传距离，分别聚集成 2 个进化分支。以上结果表明，四川地区 AcV-1分离物可分为 3 个进化分支，新西兰的分离物 K75 与分离物 HYH5 亲缘关系最近，四川地区的 AcV-1分离物间具有遗传变异现象。
▲猕猴桃果园幼果
3 讨论
本研究中基于 AcV-1 外壳蛋白基因序列设计特异性引物，对来自四川 6 个不同地区的猕猴样品进行病毒检测，首次报道了 AcV-1 在四川地区的发生情况。在 5 个采样地中，病毒检出率为 12.5% ~ 33.3%，邛崃所采集到的样品中检出率最高，广元地区因样品数太少未计算。90 份猕猴桃样品中，22 份样品为 AcV-1 阳性，总检出率为 24.4%。本研究中 14 份检出 AcV-1 的样品叶片中表现黄化，3份表现褪绿斑点，这与已报道（Blouin et al.，2018；Peng et al.，2019）的该病毒所引起的症状基本一致；但部分带病毒样品叶片无明显症状，这可能是由于该样品为病毒感染初期，还未出现明显症状。
对不同分离物 CP 基因核苷酸和氨基酸序列一致性进行分析，发现分离物间的核苷酸和氨基酸最大序列差异分别为 12.3%和 9.9%，同时本研究中发现邛崃分离物 HYH5 与新西兰分离物 K75 的CP 基因核苷酸序列一致性最高，为 97.1%，但与同一地区分离物 HYH8 的序列一致性仅为 87.7%。
通过分离物 CP 基因系统进化树分析结果表明，各分离物主要聚集在 3 个进化分支上，分离物 HYH5与新西兰分离物 K75 位于同一进化分支中。以上结果表明该病毒具有一定的分子差异，存在遗传分化现象。
Abstract：Recently，a new virus that infected kiwifruit，Actinidia virus 1（AcV-1），has been reported
in New Zealand. In order to determine the occurrence and molecular characterization of AcV-1 in kiwifruit
cultivars（‘Hongyang’and‘Jinguo’）in Sichuan Province，90 kiwifruit leaves samples of suspected viral
infection were tested for AcV-1 by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The results
showed that 22 samples were positive to AcV-1，and the infection rate was 24.4%. The coat protein gene
（CP）sequences of the obtained five AcV-1 isolates were compared with isolate K75 which was reported
in New Zealand. Results showed that the sequences identities of CP nucleotides and amino acid among
these isolates were 84.8%–97.1% and 89.7%–99.6%，respectively. Among them，the sequence identities
of CP nucleotides were less than 91% between New Zealand isolate K75 and four of these isolates except
Qionglai isolate HYH5，which was 97.1%. Phylogenetic analysis based on CP gene of each isolate showedthat these isolates were mainly clustered into three branches，HYH5 and New Zealand isolate K75 were
located in the same branch，and the other isolates were located in the other two branches.
Keywords：kiwifruit；Actinidia virus 1；RT-PCR；CP gene；molecular characterization
