摘 要：通过对‘红阳’猕猴桃基因组鉴定得到 277 个 MYB 家族成员并将其分为 12 个亚家族（S1 ~ S12），其中多数序列属于 R2R3-MYB，其次是 MYB 相关蛋白，仅鉴定到 1 个 4R-MYB。S11 和 S12 亚家族在进化上处于较早的位置，结构较为多样化，而 S1 和 S2 在进化上出现较晚。顺式作用元件分析显示，该家族主要含水杨酸、赤霉素和茉莉酸甲酯等相关植物激素元件，还有部分参与昼夜节律、低温、细胞周期等相关元件。密码子偏好性分析显示，猕猴桃 MYB 家族有 3 个高频密码子（UUG、AGA 和 AGG），基因的密码子偏好使用 A/T，第 3 位碱基偏好更强。通过顺式作用元件分析和 4 个猕猴桃品种越冬期转录组数据分析筛选了 9 个可能参与低温胁迫响应 MYB 基因，对其在低温胁迫下的软枣猕猴桃‘龙成 2 号’中进行检测验证，确认这些基因参与猕猴桃对低温的响应。
关键词：猕猴桃；MYB 家族；密码子偏好性；低温胁迫；表达
MYB 转录因子含 1 ~ 4 个不完全重复序列（Jiang & Rao，2020），每个不完全重复序列（R）是MYB 蛋白的 DNA 结合域的基本单位，具螺旋—转角—螺旋结构（Dubos et al.，2010），间隔序列则由 1 个色氨酸残基组成（Kanei-Ishii et al.，1990）。根据 MYB 蛋白包含的不完全重复结构数量，可将其分为 MYB 相关蛋白（MYB-related）、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB（3R-MYB）和 4R-MYB（Dubos et al.，2010）。其中 MYB 相关蛋白在植物生长调节和对外界刺激的应急反应中发挥重要作用（Wang et al.，2019；Yu et al.，2019）。R2R3-MYB 的数量最多，包含两个不完全重复结构，广泛参与植物的生长发育、次生代谢、环境胁迫等相关基因的转录调控（Liu et al.，2017）。R1R2R3-MYB 的成员较少，主要参与植物应对环境胁迫的反应（Feng et al.，2017）。4R-MYB 目前在植物中研究不多。MYB 调节植物初级和次级代谢。水仙（Narcissus tazetta L.）NtMYB5 和 NtMYB3 调控黄酮类生物合成（吴嘉诚 等，2018；Anwar et al.，2019）。梨（Pyrus spp.）PsMYB114 可以通过与其他转录因子相互作用调控花青素的生物合成（Yao et al.，2017）。在猕猴桃中的相关研究主要集中在花青素的生物合成方面（李贵生 等，2021），猕猴桃 AcMYB75 在果实发育过程中与花青素积累具有连锁相关性（Li et al.，2017）。
同义密码子的简并性在物种进化过程中扮演重要角色（Das & Duncan，2014）。同义密码子在不同物种、基因间存在偏好性差异（Jia & Xue，2009），如密码子 CCA 和 CCC 在水稻（Oryza sativa L.）HKT 基因同义密码子相对使用频率（relative synonymous codon usage，RSCU）为 0.58 和 1.17（杨平，2011），而在水稻扩展蛋白基因中 RSCU 为 1.56 和 0.36（施杨 等，2014）。研究认为，密码子偏好性与碱基突变（Ashesh，2002）、选择压力（Suzuki，2011）、序列保守性（Enany，2014）、基因功能（Haupt et al.，2009）等都有一定关系。
▲猕猴桃花粉通用吗
猕猴桃主要分布于 N20° ~ N50°，温度是制约北方猕猴桃引种的主要限制因素，其种间抗寒性也参差不齐，如果盲目引种、管理不当等，南种北引往往造成严重损失。MYB 家族作为植物重要转录调控因子（Chen et al.，2006a），其鉴定与分析有助于猕猴桃抗逆机理的研究。本研究中从已测序（Huang et al.，2013）的中华猕猴桃基因组数据库中鉴定 MYB 转录因子家族成员，并通过生物信息分析、密码子特征分析、低温胁迫表达分析等对其进行系统研究，为进一步加深猕猴桃抗寒机理、生物代谢等理解提供帮助，为猕猴桃 MYB 转录因子表达特性及功能研究提供分子理论基础。
1 材料与方法
1.1 MYB 家族成员鉴定
为鉴定猕猴桃中的 MYB 转录因子家族成员，使用了 Kiwifruit Genome Database（Yue et al.，2020）的基因组数据（Wu et al.，2019）文件（http：//kiwifruitgenome.org/），分别使用 HMMER（Potter et al.，2018）和 BLAST（Camacho et al.，2009）进行序列鉴定。首先使用 Pfam（Mistry et al.，2020）网站的 MYB 保守域的多序列比对文件（PF00249）（Aasland et al.，1996）构建隐马尔可夫模型。之后使用 Plant TFDB（Tian et al.，2020）下载猕猴桃的 MYB 转录因子家族成员序列，BLAST（Camachoet al.，2009）构建本地蛋白数据库，使用 Blastp 进行检索。将两种方法筛选的序列合并，并使用 CDD（Lu et al.，2020）和 Pfam 进行保守结构域鉴定，保留含有 MYB 结构域的序列。
使用 MEGA11 构建系统发育进化树（Tamura et al.，2021），通过最大似然法和基于 JTT 矩阵的模型来推断进化历史。启发式搜索的初始树是通过将 Neighbor-Join 和 BioNJ 算法应用于使用 JTT 模型估计的成对距离矩阵，涉及 277 个氨基酸序列，在最终的数据集中共有 2 838 个位置。
通过 Expasy（Wilkins et al.，1999）对猕猴桃 MYB 家族序列进行等电点（pI）和分子质量（Mw）预测。使用 TBtools（Chen et al.，2020）的 Batch Smart（Letunic et al.，2020）进行保守结构域分析。
使用 MEME 进行 Motif 分析。
提取猕猴桃 MYB 转录因子家族成员的注释信息，使用 TBtools 绘制基因结构图。基因上游 2 000 bp序列作为启动子区域，使用 PlantCARE（Lescot et al.，2002）进行顺式元件预测。使用 MCScan（Wang et al.，2012）进行分析，BLAST 提取前 5 个结果值。将包括 MYB 家族成员的区块高亮标注。外圈设置染色体基因密度，标注 MYB 基因在染色体上的定位。
使用 CodonW v1.4.4 和 EMBOSS 在线系统中 CUSP 分析密码子组成（Gupta et al.，2000）并进行密码子偏好使用分析。ENC-plot 曲线公式（Novembre，2002）为 ENC = 2 + GC3 + 29/[GC32 +（1–GC3）2]；在 PR2-plot 中，计算基因 A3/（A3 + T3）和 G3/（G3 + C3）值，表示基因碱基的偏倚程度（Sueoka，2001）。
▲猕猴桃苗
1.2 MYB 基因表达分析
试材为山东泰安市泰东试验基地正常生长的 4 个品种猕猴桃‘泰山 1 号’‘脐红’‘徐香’‘龙成 2 号’，树龄 4 年。其中‘泰山 1 号’和‘脐红’为中华猕猴桃，抗寒能力较好；‘徐香’为美味猕猴桃，抗寒能力弱；而‘龙成 2 号’为软枣猕猴桃，抗寒力较强。于 2020 年 11 月至 2021 年 4月越冬期至休眠解除期每月采集当年生 0.5 cm 粗顶端枝条，液氮速冻提取总 RNA 并进行转录组测序。对转录组表达矩阵中 MYB 转录因子家族进行了表达量分析。
对软枣猕猴桃‘龙成 2 号’盆栽苗进行低温胁迫，分析其 MYB 基因的表达。将盆栽苗在全光照培养箱（宁波赛福 ZGX-260）中 25 ℃培养 2 个月，然后移入全光照低温培养箱进行 4 ℃低温处理。设置 3 个重复。分别于低温处理 0、12、24 h 时取叶片提取总 RNA。引物见表 1，使用型号为ABI 7500Fast 的实时荧光定量 PCR 仪进行表达分析。表达量以 2-∆∆CT计算。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃 MYB 家族基因鉴定及分类
使用隐马尔可夫模型（HMM）和 BLAST 识别来自中华猕猴桃‘红阳’（Actinidia chinensis‘Hongyang’）v3 基因组的 MYB 家族成员，对上述筛选到的序列进行了保守结构域鉴定，保留最少包含 1 个 MYB 保守结构域的序列，最终共鉴定到 277 个猕猴桃的 MYB 转录因子家族成员。根据系统发育进化树（图 1）的分支，将其分为 12 个亚家族，其中大部分序列为 R2R3-MYB。S12 亚家族中包括部分 R1R2R3-MYB；S9 中包括部分 MYB 相关蛋白；仅鉴定到 1 条 4R-MYB（AcMYB260），位于 S11 亚家族中。
▲红心猕猴桃果园
2.2 猕猴桃 MYB 家族蛋白质理化性质
使用 Expasy 对猕猴桃 MYB 家族所有蛋白质序列进行等电点和分子质量预测（图 2）。S1 ~ S3亚家族的等电点和分子质量较为一致，等电点主要在 5 ~ 10 之间，其中 S2 的等电点分布更为分散；蛋白分子质量主要集中在 30 000 D 左右。S4 和 S5 亚家族等电点最高，其中 S4 跨度高达 5.66，原因可能是 S4 中的蛋白多数等电点较低，但其中 R2R3-MYB 等电点偏高，造成两极分化；S4 中的蛋白质分子质量是 12 个亚家族中最低的。S9、S10 和 S11 相似度较高，但 S9 亚家族的等电点偏碱性。S12 数据明显区别于其他亚家族，其蛋白质的等电点部分偏中性，部分偏碱性，分子质量较大，存在 1 条分子质量 100 000 D 以上的蛋白序列。
2.3 猕猴桃 MYB 家族基因结构和保守结构域
猕猴桃 MYB 转录因子的基因结构较为简单（图 3），主要包含 3 个外显子，如 S1 ~ S7 亚家族序列具有 3 个外显子，而 5′端的外显子长度明显长于其他外显子，该亚家族在进化上的位置相对靠后，具备相对稳定的内含子—外显子结构。而处于进化初期的 S11、S12 亚家族中均出现了外显子数多且数量不稳定的情况，多外显子的情况可能与其新功能的形成相关。此外，在 S10、S9 和 S8中还出现了较为明显的 UTR 结构，这在进化早期的 S11、S12 和后期的 S1、S3 中并不明显，造成此现象的原因可能是进化因素或 UTR 注释不够详尽。
▲猕猴桃花粉厂家
在保守结构域和 motif 结构分析中可以看出，S1 ~ S3 亚家族是典型的 R2R3-MYB，具有 2 个MYB-DNA-binding 结构域，包含 motif 1 ~ motif 6 的结构。在 S4 亚家族中出现了 MYB 相关蛋白，仅包含 1 个 MYB-binding 结构域，对应 motif 2 的结构，在相邻的 S5 和 S6 中同样出现部分 MYB相关蛋白的序列，仅包含 1 个 MYB-inding 结构域，且靠近 N 末端。但在 S8 中出现的 AcMYB11显示其 MYB-binding 更靠近 C 端，在 S9 中 MYB-binding 结构位于序列的中间位置，明显区分于其他分类，并且 S9 都属于 MYB 相关蛋白。S10 中同样包含 MYB-R2R3 和 MYB 相关蛋白，但其 R2R3序列中的 2 个 MYB-binding 具有较长间隔序列。S11 与 S12 的 motif 结构和序列结构都较为相似，但 S11 中 AcMYB260 具有 4 个 MYB-binding 结构域，属于 4R-MYB。在全部 12 个亚家族中，S8、S9 和 S10 有较为独特的 motif 结构，说明其与其他亚家族差异性较大，可能对应其功能的特异性。
▲猕猴桃采收
2.4 猕猴桃 MYB 家族基因启动子顺式作用元件
MYB 转录因子的启动子分析中发现了较多的植物激素响应元件，在 S8 ~ S12 亚家族中，除了水杨酸、赤霉素和茉莉酸甲酯等植物激素相关响应元件较多以外，还有分生组织相关的响应元件。昼夜节律元件在 S8 ~ S12 中有少量出现（仅 4 次），但在进化后期出现较多；另外损伤响应元件在S8 ~ S12 中没有出现，说明该元件是 MYB 进化后期逐渐出现的调控元件，对于该家族的新功能化具有重要意义。
2.5 猕猴桃 MYB 家族基因定位和共线性
MYB 家族成员在各染色体上均有分布，定位于染色体 Chr3 和 Chr9 的基因最多（15 个），最少的为 Chr10 和 Chr27，仅有 4 个，有 15 条序列分布在尚未组装到染色体上的长片段上。共线性分析发现，48 个 MYB 家族基因可能产生于转座，如“复制性转座”“非复制性转座”或“保守性转座”，4 个基因可能产生于小规模的转座，或产生于串联复制和插入其他一些基因，3 个产生于串联重复事件，其余的 222 条序列产生于全基因组复制或片段复制。Chr3 和 Chr22 之间的 MYB 家族共线性基因对最多。在各亚家族中 S12 是发生共线性最多的，而相邻的 S11 最少，仅有 61.29%的序列发生了复制。
▲红心猕猴桃图片
2.6 猕猴桃 MYB 家族密码子偏好性
计算 MYB 家族同义密码子相对使用频率（图 4），发现 MYB 家族有 3 个高频密码子，分别是UUG（编码 Leu）、AGA 和 AGG（均编码 Arg），编码同一氨基酸的密码子使用频率差异高达 4.35倍。各亚家族密码子使用也有差异，高频密码子数量最多的为 S1（7 个）和 S8（7 个），最少的为S9（仅 2 个），密码子 UUG 和 AGA 在除 S9 以外的亚家族中都有较强的偏好性，S9 的密码子更倾向于平均使用。
ENC-plot 分析（图 5）显示，277 个 MYB 家族成员主要分布于理论曲线左下方，有效密码子数（effective number of codon，ENC）随密码子第 3 位碱基为 GC 含量的增加而增大，少数分布在右侧（S4、S5、S9、S10、S11），表明猕猴桃 MYB 家族存在密码子偏好且受自然选择压力等因素影响；而分布于 ENC 曲线上的基因趋向于使用随机密码子，密码子偏性主要由基因突变造成。
▲redkiwifruit猕猴桃▲
密码子 R2-plot 偏倚分析（图 6）显示，猕猴桃 MYB 成员主要聚集在中部偏下，各亚家族 A3/（A3 + T3）均值介于 0.44 ~ 0.49，G3/（G3 + C3）介于 0.45 ~ 0.56，说明密码子第 3 位碱基为 T 的频率大于A，而G/C 则趋向于平均使用。MYB 家族平均GC 含量为0.462，GC3 为0.439，T3（0.371）> A3（0.333）> G3（0.292）> C3（0.277），表明该基因家族整体偏好 A/T 密码子，第 3 位碱基的 A/T偏好性更强。
▲sungold g3 kiwifruit vine
2.7 猕猴桃 4 个品种 MYB 家族在越冬期—休眠解除期表达模式
使用本课题组之前对‘泰山 1 号’‘脐红’‘徐香’‘龙成 2 号’越冬期—休眠解除期进行转录组测序获得的 MYB 家族成员表达数据作热图（图 7）。其中有 7 个基因（AcMYB105、AcMYB200、AcMYB50、AcMYB65、AcMYB30、AcMYB40 和 AcMYB83）在 1 月和 2 月具有较高的表达量（图 7，A），推测其与植株的脱休眠恢复生长发育相关。另外有 49 条序列在 3 月和 4 月具有较高的表达量，推测其与休眠结束后的叶芽和花芽的诱导生长相关（图 7，B）。有 15 个基因在 11 月到翌年 2 月间的表达量整体高于其后的 3 个月（图 7，C），可能与维持植物体的休眠或者应对外界低温环境相关。
▲kiwifruit▲
2.8 猕猴桃 MYB 成员在低温胁迫下的表达模式
通过对 MYB 家族成员顺式作用元件（低温响应元件、防御和应激反应元件）分析以及越冬时期表达模式分析，筛选出 8 个可能参与低温响应的基因在低温胁迫下的软枣猕猴桃‘龙成 2 号’中进行检测验证。结果（图 8）表明，8 个基因均对低温胁迫有响应，其中 AcMYB200、AcMYB61、AcMYB63、AcMYB235 的表达随低温胁迫时间延长呈逐渐上升趋势，AcMYB123 在低温处理 12 h 后其表达进入平台期，而 AcMYB56、AcMYB71 和 AcMYB210 表达量在低温胁迫 12 h 到达顶峰，随后下降。说明此类基因受低温胁迫后响应较为迅速。
▲红心猕猴桃果袋
3 讨论
鉴定到的猕猴桃 MYB 家族 227 个基因可为 S1 ~ S12 亚家族，各亚家族间理化性质存在差别，较为特殊的 S11 和 S12 分子质量相对更大，等电点分布较分散。鉴定到 R1R2R3-MYB 属于 S12，4R-MYB 属于 S11，序列结构多样化。值得注意的是，S11 和 S12 亚家族的 Motif 结构与 S1、S2 和S3 相似度较高，而与 S8、S9 和 S10 差别较大，猜测 S8、S9 和 S10 具有相同的起源。S8 和 S9 亚家族大多为 MYB 相关蛋白类。对基因结构进行分析，发现多数基因具有 3 个外显子，但在进化较早的 S11 和 S12 亚家族中多数序列不是，且 S12 外显子结构更为复杂。在 S8、S9 和 S10 中具有较为规律的外显子结构，而在 S1 ~ S7 中，序列趋向于两短一长的外显子结构。基因复制分析发现，基因复制和转座事件是导致基因家族成员数量增多和真核生物基因组复杂性的主要因素（Hughes，1994）。MYB 家族大多数基因是全基因组复制或者片段复制生成，在 S8、S10 和 S11 亚家族中出现Mao Kexin，An Miao，Wang Hairong，Wang Shijin，Lü Wei，Guo Yingtian，Li Jian，Li Guotian. Identification and Low temperature expression analysis of MYB transcription factor family in kiwifruit. 546 Acta Horticulturae Sinica，2023，50 (3)：534–548.了较多转座产生的基因，在 S2 和 S11 中出现了串联复制产生的基因。
▲猕猴桃采收
猕猴桃 MYB 家族中共发现 3 个高频密码子，分别是 UUG、AGA 和 AGG，其中 S9 亚家族密码子偏性较弱。通过计算发现，猕猴桃 MYB 基因整体偏好 A/T 密码子，并且 T3（0.371）> A3（0.333）> G3（0.292）> C3（0.277），第 3 位碱基有很强的 A/T 偏好性。有研究证实，基因转录水平与密码子偏好呈正相关性（Wang & Roossinck，2006），基因中高频密码子的种类与数量与基因表达强度也有密不可分的联系（Zhang et al.，2019）。对外源基因进行密码子优化后，基因表达水平能提高 4.0 ~ 5.7倍（Yan et al.，2016），同样，密码子偏好性优化能使 mRNA 翻译速率提升，对肽链合成具有促进作用（侯倩倩，2019）。因此，研究猕猴桃 MYB 家族密码子偏好性能为今后 MYB 基因的异源改造提供研究思路。
研究表明，MYB 在干旱、盐和冷胁迫等非生物压力方面发挥作用（Wang et al.，2021），同时参与初级、次级代谢，发育等生物进程（Chen et al.，2006b），例如花青素的生物合成（Liu et al.，2015；Cao et al.，2020；Yan et al.，2021）等。还有研究证明 MYB 转录因子在植物应激反应，尤其是应对非生物胁迫中具有关键性作用（Baldoni et al.，2015；Roy，2016；Li et al.，2019）。随着植物全基因组测序的陆续完成，基因家族的研究逐渐开展，许多物种 MYB 家族基因已有所研究和鉴定（Dubos et al.，2010）。本研究中，筛选出了 8 个可能参与低温胁迫响应的 MYB 基因（AcMYB200、AcMYB61、AcMYB63、AcMYB56、AcMYB71、AcMYB123、AcMYB210 和 AcMYB235），对软枣猕猴桃进行 4 ℃低温胁迫处理，并经 qRT-PCR 表达分析证实了这一猜测，为猕猴桃低温抗性研究提供了基因参考，MYB 基因家族的分析有助于为北方猕猴桃抗寒性分子育种奠定分子基础。
▲redkiwifruit猕猴桃
Abstract：In this paper，277 MYB family genes were identified through the genome of Actinidia chinensis‘Hongyang’. The MYBs were classified into 12 subclasses（S1–S12），most of the sequences belong to R2R3-MYB，followed by MYB-related proteins，and only one 4R-MYB identified. S11 and S12 were at an earlier evolutionary position with more diverse response structures，never the less S1 and S2 were at a later evolutionary position. The cis-acting element analysis showed that the main related phytohormones elements of this family are salicylic acid，gibberellin，and methyl jasmonate，further，there are elements partly involved in the regulation of circadian rhythm，low temperature，and cell cycle，etc.
Codon preference analysis showed that the kiwifruit MYB family had three high-frequency codons （UUG，AGA and AGG）. The codon preference of the gene was A/T，and the third base preference wasstronger. Through the cis-acting elements and transcriptional data of four varieties kiwifruit in winter，nine MYB genes which possible response to cold stress . It was confirmed that these genes were involved in the response to low temperature by detecting and verifying in Actinidia arguta‘Longcheng 2’. Keywords：kiwifruit；MYB family；codon usage bias；low temperature stress；expression
（猕猴桃花粉怎么人工授粉）
