已证实猕猴桃花粉是溃疡病远距离传播的主要途径之一。研究60Co-γ辐照、臭氧、紫外、微波、梯度水浴（35、50、80、100 ℃）等5种物理灭菌方法，ClO2、乙蒜素、四霉素、春雷霉素、氧化亚铜、代森铵、中生菌素和纳米银等8种化学药剂杀菌方法，对猕猴桃花粉溃疡病菌杀灭率、花粉活力、坐果率、单果质量和果实品质的影响。结果表明，紫外、微波、水浴和乙蒜素、四霉素、春雷霉素、代森铵处理的杀菌率较低，且花粉活力显著降低；60Co-γ辐照和ClO2、中生菌素、纳米银及氧化亚铜虽可保证有效的杀菌率及花粉活力，但会造成授粉后坐果率、单果质量、大小、硬度、可溶性固形物、干物质、维生素C含量、可溶性糖及可滴定酸等显著下降；642.85mg·m-3臭氧1h的花粉灭菌效果最佳，灭菌率达99.52%，花粉活力仅下降2.92%；坐果率、果实硬度、维生素C含量、可溶性糖、可滴定酸、果实单果质量、大小、干物质及可溶性固形物变化不大。结合成本、可操作性及环保等多因素考虑，臭氧处理是其中最有效且安全的猕猴桃花粉灭菌方法。
▲中科院湖北武汉植物园国家猕猴桃种质量资源圃
猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）是20世纪由野生到商业栽培最成功的植物驯化范例之一。中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃栽培品种的发源地，据联合国粮农组织（FAO）的数据，至2019年12月，中国猕猴桃总结果面积已占全球总结果面积的 67.92%，成为世界最大的猕猴桃生产国。
自2007年以来，丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病在世界范围内大面积爆发，严重危害了世界猕猴桃产业的健康发展（李黎等，2013；Pereira et al.，2021）。猕猴桃为功能性雌雄异株，其花粉特性对坐果率、果肉颜色、果实大小、品质、产量等具有决定性作用（齐秀娟等，2016）。近年来已证实带菌花粉为猕猴桃溃疡病大范围远距离传播的主要途径之一，在新西兰、意大利、智利及阿根廷的猕猴桃花粉中均检测到溃疡病菌（Vanneste et al.，2011；Tontou et al.，2014；Balestra et al.，2018；Kim et al.，2018）。
（中科院湖北武汉植物园）
本团队调查发现中国部分果园不按雌雄配比栽培雄株，甚至不栽植雄株，采用未经灭菌的花粉人工授粉，加速了溃疡病传播（钟彩虹等，2020）。尽快建立既能杀灭花粉中Psa病菌又能保持花粉活力，且对果实产量品质无显著影响的灭菌方法，对防止猕猴桃溃疡病菌通过花粉快速传播，降低其对猕猴桃产业造成的经济损失具有重要的指导意义。本研究在前期展开的溃疡病菌最佳防治药剂评价工作的基础上，比较分析了60Co-γ辐照、臭氧、紫外、微波、梯度水浴（35、50、80、100 ℃）等5种物理灭菌方法，和ClO2、乙蒜素、四霉素、春雷霉素、氧化亚铜、45%代森铵、中生菌素、纳米银等8种化学药剂杀菌方法，对花粉溃疡病菌杀灭率、花粉活力及坐果、产量、品质的影响，拟通过系统比较分析，建立高效、绿色、环保的猕猴桃花粉灭菌技术体系。
▲猕猴桃花粉萌发培养
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试猕猴桃溃疡病菌菌株2个，其中C30菌株分离自四川省都江堰市虹口乡，C48菌株分离自湖南省常德市东山峰农场（Honour et al.，2017）。供试猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）花粉（2019 年采集）由陕西佰瑞猕猴桃研究院有限公司惠赠。2019年9-12月，在中国科学院武汉植物园猕猴桃组病理实验室完成室内花粉灭菌率及活力分析；2020年4月，在湖北广水、赤壁及武汉的猕猴桃实验基地完成田间授粉试验；2020 年9-10月，在中国科学院武汉植物园猕猴桃组采后实验室完成果实品质检测。
▲猕猴桃花粉萌发培养
1.2 试验方法
1.2.1 Psa病原菌培养及花粉染菌
将C30菌株和C48菌株在KB 固体培养基（20克蛋白胨、1.5克MgSO4·7H2O、10毫升甘油、15克琼脂粉定容至1升，121℃高压灭菌 30min）上划线培养，在24℃、相对湿度为70%条件下培养2天。挑取单菌落接种在10mmol ∙ L MgSO4无菌溶液中，恒温振荡培养12小时，稀释菌悬液浓度至106cfu · mL-1。准确称取10克 猕猴桃花粉，将10毫升浓度为106cfu · mL-1的 Psa菌悬液均匀喷湿在花粉上，自然晾干，–20℃保存备用。
▲中科院湖北武汉植物园国家猕猴桃种质量资源圃
1.2.2 物理方法灭菌
60Co-γ射线辐照：分别取染菌和无菌花粉各21克，分为21份，每份1克，置于灭菌玻璃瓶中密封，随后在辐照装置上动态连续辐照。放射源为 60Co，放射性活度为3.7×1010Bq，设定7个剂量（表1）。试验在常温条件下进行，由湖北省农业科学院核农加工研究所协助完成。
臭氧：称取染菌和无菌花粉各18g，分为18份，每份1g，平铺在称量纸上，置于流通臭氧的透明塑料盒中，设定3个臭氧浓度和2个作用时间（表 1），共6个处理。
紫外线：称取染菌和无菌花粉各3g，分为3份，每份1g，平铺在称量纸上，置于超净工作台中强度20W的紫外灯下培养24h，样本与灯管之间距离50cm。
微波加热：称取染菌和无菌花粉各3g，分为3份，每份1g，置于灭菌烧杯中，700W微波处理90秒后翻动花粉散热2分钟。
梯度水浴：基于Evreett等（2012）的方法，每处理称取染菌和无菌花粉1g，分别置于灭菌烧杯中 35、50、80、100℃水浴培养，水浴时间见表 1。
▲猕猴桃花粉萌发培养
1.2.3 化学方法灭菌
供试化学药剂共8种，包含ClO2、乙蒜素、四霉素、春雷霉素、氧化亚铜、45%代森铵、中生菌素及纳米银溶液（表2）。准确称取染菌花粉0.1g，置于100mLKB液体培养基（20g蛋白胨、1.5g MgSO4·7H2O、10mL甘油定容至 1L，121 ℃高压灭菌30 min）中，24℃、200r · min-1过夜培养12小时，稀释菌悬液浓度至 106cfu·mL-1。分别吸取菌悬液 1mL 加入 4mL 供试化学试剂中，充分混匀，作用时间梯度设定为15、30、45、60 min，以无菌水为空白对照。
▲高活性猕猴桃花粉
1.2.4 不同灭菌方法的抑菌率分析及对花粉活力影响
物理方法处理后，分别取 0.5g花粉于500µL 10 mmol∙L-1 MgSO4 溶液中，45Hz 研磨120s后稀释涂板，24℃培养48h，用菌落计数法进行计数。化学方法处理后，吸取菌悬液和试剂混合样本100μL进行稀释涂板，24℃培养48h，用菌落计数法进行计数。以未处理染菌花粉作对照。对2个菌株，分别设置 6 个涂板重复。灭菌率（%）=（对照菌落数–处理菌落数）/对照菌落数×100。
用离体萌发法进行活力测试。在载玻片上涂薄薄一层培养液（10g蔗糖，0.8g琼脂，1mL硼酸，加双蒸水至100mL）作为发芽床。对物理方法处理的样本，用牙签将花粉轻轻撒在载玻片上；对化学方法处理样本，取10μL花粉悬液于载玻片上。在培养皿中铺上一片滤纸，用无菌水浸湿。将载玻片放入培养皿中加盖玻片，20~25℃放置24小时在10倍显微镜下观察，以花粉管长度≥花粉直径的一半视为萌发。各样本取3个视野，每个视野的总花粉数不少于100个，以未处理花粉为对照（杨红等，2015）。花粉活力（%）=萌发花粉粒数/观察花粉粒数×100。
▲播宏猕猴桃花粉
1.2.5 田间验证试验
选取效果较好的6种处理方法（表3）进行田间验证试验。在湖北广水、赤壁和武汉各选1个猕猴桃园为试验地，选取健康、无病害、树势相近的‘翠玉’品种植株32株，4株为1个试验组。
授粉前将所有雌花在大蕾期（4月15—17日）进行套袋。盛花期（4月22—26日）晴天清晨解开套袋并进行人工授粉，然后立即再套袋。待猕猴桃花瓣自然脱落后除袋。将未经处理或用无菌水处理的花粉分别作为物理和化学方法对照。将物理方法处理后的花粉与辅料按1︰5混合均匀后点授。将化学方法处理后的花粉进行中和（中和剂，0.5g 硫代硫酸钠、2.0mL 吐温 80）后立即液体授粉（曹凡等，2018），授粉溶液现配现用（超过2小时花粉会逐渐失去活力影响授粉效果）。为保证授粉的一致性，每朵雌花只授粉 1 次。
授粉结束10天内（4月28日—5月6日）调查各树坐果率。坐果率（%）= 坐果数/授粉花朵数×100。9月下旬果实成熟期（24—28日）随机采果，每个果园每个处理各60个果实。采摘当天检测30个果实的单果质量、果实大小（纵径、横径、侧径）、硬度、干物质及可溶性固形物；其他30个果实置于室温条件下放至微软熟（硬度降至 1kgf以下），采用果蔬硬度计测定果实硬度；采用折光仪测定可溶性固形物含量；采用2,6–二氯靛酚法测定维生素C含量；采用DNS方法测定可溶性糖含量；采用氢氧化钠滴定法测定可滴定酸含量（黄文俊等，2020；国标NY/T2742-2015）。
▲猕猴桃花粉灭菌方法灭菌率及对花粉活性的影响
2 结果与分析
2.1 物理处理对花粉溃疡病菌的杀灭率和花粉活力影响整体上，随着处理强度增加或时间延长，Psa 杀灭率增加，花粉活力降低（表1）。辐照剂量为800~1600 Gray的 60Co-γ 辐照灭菌率高于97.5%，其中1000Gray 灭菌率达99.50%，花粉活力仅下降3.50%。642.85 mg ∙ m-3 臭氧处理1小时 的灭菌率可达99.52%，花粉活力仅下降2.92%。其他方法效果不佳，如紫外线、微波、35℃及50℃热处理的杀菌率均低于75%，80℃及沸水浴处理的杀菌率虽较高，但会造成花粉完全失活。因此，综合灭菌率及花粉活力下降率分析，642.85mg·m-3臭氧1小时和1000 Gry 60Co-γ 辐射的效果最好。
▲猕猴桃花粉灭菌方法灭菌率及对花粉活性的影响
2.2 化学药剂处理对花粉溃疡病菌的杀灭率和花粉活力影响
由表2可知，中生菌素、ClO2 溶液及乙蒜素的杀菌率最优，处理15min以上杀菌率均可达到98.98%~100.00%；纳米银和四霉素处理45min及60min时杀菌率可达到99.98%~100%；代森铵、氧化亚铜及春雷霉素的杀菌率相对较低。乙蒜素和代森铵处理，花粉活力大幅度降低或完全失活；其他药剂也会造成花粉活力不同程度下降。综合分析，3%中生菌素 800倍处理60min、0.15mmol∙L-1ClO2 溶液、86.2%氧化亚铜 1000倍和0.2%纳米银溶液处理 45min效果较好，对花粉中Psa病菌的杀死率分别为100%、100%、99.10%及99.98%，花粉活力分别下降9.25%、6.25%、7.66%及 9.42%。
▲猕猴桃花粉灭菌方法比较及对果实品质的影响
2.3 灭菌花粉对猕猴桃坐果及果实品质的影响
由表3 可知，与花粉活力试验结果正相关，在6种效果较好的处理中，除氧化亚铜外其他5种灭菌花粉的坐果率均无显著变化。但 60Co-γ 辐射会导致果实变小，硬度、干物质及可溶性固形物含量均有不同程度的下降；臭氧处理明显优于60Co-γ 辐射，果实单果质量、大小、可溶性固形物、干物质与对照基本一致，仅硬度有小幅度下降。4种化学方法处理后，果实单果质量、大小、硬度指标均显著下降，干物质及可溶性固形物含量变化不大；其中氧化亚铜处理坐果率最低，但对果实大小的影响最小。
▲猕猴桃花粉灭菌方法比较及对果实品质的影响
由表4可知，物理处理花粉对果实品质的影响不大，但维生素C含量略有下降；化学处理中ClO2与对照相比无差异，其他处理各指标有不同程度下降。相对而言，臭氧和 ClO2处理对果实软熟指标的影响较小。
▲给猕猴桃授粉
3 讨论
在溃疡病发生前，国内外对猕猴桃花粉的研究主要在质量、活力及类型对果实性状的影响上（李鹏，2017）。2007年以来，猕猴桃溃疡病从意大利暴发蔓延，各国科学家开始解析该病菌的传播途径（Gallelli et al.，2011）。Stefani 和 Giovanardi（2011）通过温室及田间试验发现，运用被污染的花粉进行授粉会导致健康花朵上Psa附生，首次证实溃疡病菌会随花粉传播。Braggins和Saunders（2012）检测发现田间花药上溃疡病菌浓度约为1.8×107 cfu·g-1。Donati 等（2018）利用荧光及共聚焦显微镜观察发现 Psa病原菌可附生或内生定殖在雄花花药上并呈点状分布，在花粉囊裂口处也可观察到带菌花粉，直观地证实了花粉是 Psa病菌远距离传播的主要途径之一。
▲猕猴桃花粉萌发培养
目前对花粉进行物理灭菌研究较多，常用的方法有乙醇、湿热、微波、辐照、紫外线杀菌等（延莎等，2020）。10000 Gry 的 60Co-γ 辐照在蜂花粉的灭菌中效果较好，能有效杀灭微生物，且对营养成分没有明显影响，不存在放射性残留问题（罗志平等，2015）；功率10kW、传送频率10Hz、物料厚度 1.0cm及14min的微波处理，结合30℃、60%相对湿度、8h的干燥加热工艺为松花粉的最佳灭菌处理条件（李海龙等，2015）。针对猕猴桃花粉，新西兰 Everett 等（2012）首次进行热处理灭菌研究，发现短时间的高温高湿有利于快速杀灭溃疡病菌，但也会严重影响花粉活力，如当Psa浓度为 107cfu·mL-1时，55℃及 50%湿度条件下处理3.1min，Psa杀灭率达90%，但花粉活力下降50%；而当温度不变，湿度降低时，花粉活力下降变缓，但是 Psa生存时间也随之延长；最终确定35℃、30%湿度条件下处理20h或以上，能有效去除 Psa且对花粉活力影响较小。曹凡（2018）分析了不同浓度的臭氧对猕猴桃花粉的影响，发现在浓度为 600mg·m-3 的条件下处理30min，溃疡病菌的杀菌率可达90.77%，花粉活力下降9.66%，果实坐果率、总质量、单果质量和种子数分别下降7.56%、0.76%、0.76%和 8.9%，适宜猕猴桃花粉灭菌。
▲贵州猕猴桃花粉
本研究中在验证热处理及臭氧方法的灭菌率及花粉活力情况的同时，选用了前期在花粉灭菌研究方面报道较好的 5种物理灭菌方法进行对比分析，并增加了对果实的品质分析。结果表明紫外线、微波、35℃和 50℃热处理的杀菌率均低于 75%，与 Everett等（2012）的报道存在一定差异；80 ℃和 100℃处理的杀菌率较高，但会造成花粉完全失活；同时发现浓度为642.85mg·m-3的臭氧处理1 h 灭菌率高达99.52%，花粉活力仅下降2.92%；1000 Gray的60Co-γ 辐照灭菌率达99.50%，花粉活力仅下降3.50%。相较而言，60Co-γ 辐照需要在专业机构完成，花粉来回运输可能会造成活力降低；臭氧处理成本低，易操作，在与氧气的转化过程中没有二次残留及二次污染物产生，相对绿色环保，优势明显。臭氧处理后坐果率、单果质量、果实大小、可溶性固形物、干物质含量变化不大，仅硬度稍微下降；而软熟阶段仅维生素C含量有所下降。本研究的结果与曹凡（2018）的基本一致，并进一步证实了臭氧处理可有效维持果实的品质。
在化学处理方面，曹凡等（2018）分析发现10mg·L-1 ClO2 溶液处理 45min，灭菌率高于99%，活力下降0.5%，坐果率下降12%，对果实总产量、单果质量均无明显影响。本研究中对 8 种化学药剂对猕猴桃花粉的灭菌率及活力影响进行了对比分析，发现 3%中生菌素800× 处理 60min、0.15mmol∙L-1 ClO2 溶液、86.2%氧化亚铜 1000×及0.2%纳米银溶液分别处理 45min的花粉中 Psa病菌的杀死率均接近100%，花粉活力下降值介于6.25%~9.42%之间。进一步研究结果表明化学处理均会造成坐果率、果实大小、下树及软熟期间的可溶性固形物、维生素C、可溶性糖及可滴定酸指标不同程度的降低。由于目前液体授粉操作较为繁琐，在猕猴桃产业中的应用率仍不高，且前期研究证实溃疡病菌更易通过液体授粉传播（Stefani & Giovanardi，2011），因此从应用前景来看，臭氧物理处理优于化学药剂处理。
▲播宏公司位于贵州遵义的猕猴桃花粉采摘园，国内唯一全部自有种植基地生产的猕猴桃花粉
此外，不论物理或化学方法处理，大部分处理剂量升高和时间延长会使 Psa 的杀灭率逐渐增加，花粉活力逐渐下降。但部分处理中会出现波动，如 60Co-γ、臭氧、50℃水浴、中生菌素、四霉素、氧化亚铜及纳米银处理。Everett等（2012）发现 Psa 灭菌率及花粉活力在不同温度、湿度条件下的回归方程完全不同，部分处理的灭菌率会呈现倒U形，原因可能与花粉和病菌的耐热、耐湿机理有关。曹凡等（2018）发现0.10 mg·L-1噻霉酮处理花粉 15~60min，Psa杀灭率随时间延长出现了先降后升的趋势；使用同一浓度的 ClO2处理花粉后，处理前30min花粉活力逐渐下降，但处理后期花粉活力呈上升趋势，可能与不同药剂的化学特性有关，有待进一步深入研究。综上，结合各处理对花粉的灭菌率、活力及果实品质等多项指标的影响、经济实用性及可操作性考虑，认为臭氧技术处理花粉最适合目前猕猴桃产业的发展。此外，近年多项研究证实臭氧处理可显著降低由灰葡萄孢霉和扩展青霉菌引起的病害发病率，维持果实较高的硬度、可溶性固形物、可滴定酸和维生素C含量，延缓贮藏过程中果实乙烯释放，提升抗性酶活性，延缓果实后熟衰老。由此可见，臭氧在猕猴桃产业的采后病害及贮藏方面也具有良好的应用前景。本团队将进一步针对猕猴桃花粉及果实的臭氧处理工艺及装置进行设计改良，希望研究结果能尽快服务于猕猴桃产业。
本文发表于园艺学报, 2022, 49 作者：李黎 冯丹丹 潘慧 李文艺 邓蕾 汪祖鹏 钟彩虹
公司有红心猕猴桃采摘园、猕猴桃苗圃、猕猴桃花粉园，其中猕猴桃花粉项目是中国单体面积最大的猕猴桃花粉园，单个采粉园达到了400亩，丰产期产花粉200公斤，可以满足15000亩果园的花粉需要。公司主要致力于猕猴桃生产、销售、批发、零售、团购，猕猴桃苗木以及猕猴桃雄株园管理。 引进人才进行技术指导，倡导给中国猕猴桃果园使用当年新鲜的花粉。
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▲猕猴桃花粉灭菌方法灭菌率及对花粉活性的影响
▲猕猴桃花粉灭菌方法灭菌率及对花粉活性的影响
▲猕猴桃花粉灭菌方法比较及对果实品质的影响
▲猕猴桃花粉灭菌方法比较及对果实品质的影响
关键词: 猕猴桃, 溃疡病, 花粉, 灭菌方法, 灭菌率, 活力, 果实品质
Abstract:
Pollen has been proved to be one of the main pathways for long-distance transmission of kiwifruit bacterial canker（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,Psa）. Five physical sterilize methods including 60Co-γ irradiation,ozone,UV,microwave,water-bath heating（35,50,80,100 ℃）,and eight chemical sterilize methods including ClO2，ethylicin，tetramycin，kasugamycin，cuprous oxide，amobam，zhongshengmycin and sliver nanoparticles were applied to analyze the effect to kiwifruit pollen. The index of Psa sterilization rate,pollen viability,fruit setting rate,single fruit weight and fruit quality were analyzed. The results showed that the sterilization rate and pollen viability of partial treatments are relatively low,such as UV,microwave,water-bath heating，ethylicin，tetramycin，kasugamycin and amobam solution。Other treatments caused the index including fruit setting rate,single fruit weight,size,fruit firmness,soluble solids,dry matter,vitamin C,soluble sugar and titratable acid content decreased significantly，such as 60Co-γ irradiation，ClO2,cuprous oxide，Zhongshengmycin and sliver nanoparticles.
(猕猴桃花粉)
The optimum disinfection method is ozone with concentration of 642.85 mg · m-3 for 1 h,the Psa sterilization rate reached 99.52% while the decline rate of pollen viability was merely declined 2.92%. The fruit setting rate,fruit firmness,vitamin C,soluble sugar and titratable acid,single fruit weight,size,dry matter and soluble solids index decreased slightly without significant difference. Comprehensive analysis the cost,operability and environmental protection factors,ozone technology can be regarded as the most effective and safe method for kiwifruit pollen sterilization.
Key words: kiwifruit, bacterial canker, pollen, sterilization method, sterilization rate, viability, fruit quality
(猕猴桃花粉授粉)
(猕猴桃授粉)
(猕猴桃蜜蜂授粉)
