红阳猕猴桃高效再生体系的建立及抗病基因LJAMP2的导入
周月
【摘要】：猕猴桃营养丰富,风味独特,被誉为“水果之王”。‘红阳’猕猴桃果肉黄绿色,横截面具放射状血红色条纹,含糖量高于其它猕猴桃品种,果汁鲜美,商品价值高。但猕猴桃属雌雄异株植物,倍性复杂,雌雄株间花期不遇，致使种间杂交困难,育种周期长,具有不确定性。采用播种等常规繁殖方式容易造成品种退化,而利用组织培养方法可保持良种遗传性状和实现大量繁殖。近年来,国内主要对中华猕猴桃,国外主要对美味猕猴桃进行了组织培养研究,但繁殖效率普遍较低,且对红阳猕猴桃的研究太少。因此,在猕猴桃育种中,迫切要求采用新的技术与手段改变其传统育种现状。同时,猕猴桃包括红阳猕猴桃在生产栽培中易遭受病虫害。在诸多病害中,溃疡病最为突出,而传统生产中农药的使用会带来很多副作用。植物基因工程技术为猕猴桃的抗病育种提供了一条新途径。 本研究以红阳猕猴桃茎段和叶片为外植体,通过茎段不定芽诱导与增殖和生根等培养基的筛选,通过叶片直接再生和不定芽增殖培养基的筛选以及良好根系的诱导形成建立了高频再生体系,为红阳猕猴桃的抗病基因工程育种奠定了良好基础。通过影响转化频率的诸因素水平筛选,建立了遗传转化体系。经GUS染色和PCR分析,初步证明外源抗病基因LJAMP2已成功整合到红阳猕猴桃基因组中。 主要研究结果如下： 1.茎段高效再生体系的建立。结果表明,最佳愈伤组织诱导培养基为MS+1.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA,茎段外植体培养30d，愈伤组织诱导率达100%：最佳愈伤组织增殖培养基为MS+2.0mg·L-12,4-D+0.4mg·L-16-BA,愈伤组织培养20d,1～4代平均增殖系数为3.38(倍)；最佳不定芽诱导培养基为MS+5.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA,愈伤组织培养60d,不定芽诱导率达83.33%,每块愈伤平均出芽数7.5个。最佳不定芽继代培养基为MS+3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,不定芽培养20d,1～6代平均繁殖系数达6.78；不定芽经0.01%IBA处理40min,在1/2MS培养基中20d生根率达100%,试管苗在含1/2MS液体培养基的珍珠岩中培养20d,根系发育良好。抽取85株试管苗移栽到田间营养钵中，15d后成活81株,成活率达95.29%。 2.叶片直接高效再生体系的建立。结果表明,最佳直接出芽培养基为MS+3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,叶片外植体培养40d,不定芽诱导率达100%,平均出芽数18.67个/叶盘；在MS+2.0mg·L-1BA+1.0mg·L-1NAA+0.1mg·L-1GA3培养基中,30d增殖率达100%,1-6代不定芽平均繁殖系数达8.63；适宜壮苗培养基为MS+0.4mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA,不定芽伸长生长迅速；伸长后的不定芽在含0.8mg·L-1IBA的1/2MS培养基中诱导生根15d后,在1/2MS基本培养基中培养15d(共生根30d),生根率达100%,根系发育良好。98株试管苗移栽到田间土营养钵中,30d成活95株,成活率达96.94%。 3.卡那霉素(Kan)选择压、抑菌抗生素及其浓度的确定。以叶片直接再生体系为实验系统,研究了不同抗生素对外植体生长的影响。结果表明,不定芽分化受高浓度Kan抑制。培养基中不含Kan时,外植体分化正常；含15mg·L-1Kan时,叶片形成少量愈伤组织(愈伤形成率8.56%),但没有不定芽分化;含20mg·L-1Kan时,愈伤组织形成和不定芽分化完全被抑制,外植体颜色逐渐变浅直至发白、死亡；含30mg·L-1Kan时,叶片完全褐化、死亡。因此,Kan选择压(临界浓度)确定为20mg·L-1。100～500mg·L-1头孢霉素(Cef)不能抑制农杆菌生长,400mg·L-1羧苄青霉素(Carb)能很好抑制农杆菌生长,且在最佳直接出芽培养基中,不定芽再生率达100%。因此,适宜的抑菌抗生素为Carb,其使用浓度为400mg·L-1。 4.影响转化频率的其它因素最佳水平的确定。以叶片为外植体,研究了影响转化频率的诸因素最佳水平。结果表明,诸因素的最佳水平分别为：预培养时间为3d、农杆菌浸染浓度为OD600=0.5,菌液中乙酸丁香酮(AS)含量为100μmol·L-1,浸染时间为10min,共培养为48h。 5.转基因植株的获得。采用根癌农杆菌介导法,转化来源于益母草的阳离子抗菌肽基因LJAMP2。经Kanr筛选,共获得40株Kanr植株,经GUS组织染色和PCR检测,23株Kanr植株呈阳性,阳性植株达57.50%,证明外源基因LJAMP2已成功整合到红阳猕猴桃基因组中。
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