刘芸宏
【摘要】：猕猴桃溃疡病是细菌性疾病,已严重危害到了中国乃至全球猕猴桃产业的发展,已经成为了全国森林植物的重点检疫对象。丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)是引发猕猴桃溃疡病的病原菌,Psa-V(Pseudomonas syringae pv.actinidiae virulent strains)是Psa中的强毒株,致病力强,是导致我国猕猴桃溃疡病爆发的主要病原菌。猕猴桃花粉携带Psa-V是导致其远距离传播的重要因素。因此加大对猕猴桃花粉中Psa-V检测力度对防止猕猴桃溃疡病的发生具有比较重要的意义。本研究采用普通PCR对陕西猕猴桃花粉样品进行Psa-V检测,并建立利用PMA-qPCR以及RT-PCR对Psa-V活菌进行检测的方法,为花粉消毒,减少花粉传播Psa-V提供技术支撑。主要结果及结论如下:1.陕西猕猴桃产区商品花粉中Psa-V普通PCR检测抽取36份商品花粉样品采用普通PCR进行Psa-V检测。结果表明,共有27个样品结果呈阳性,阳性概率为75%,对结果为阳性的样品进行测序分析可得出,呈现出阳性结果的27个样品均为Psa-V。2.基于PMA-qPCR的Psa-V活菌检测将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合,建立陕西猕猴桃产区Psa-V活菌定量检测方法。通过优化PMA最佳浓度、暗育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件,结果表明,Psa-V经98.3℃沸水浴处理13 min可完全致死,Psa-V死菌浓度为1×107 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105 ug/mL,最佳暗育时间为8 min,最佳曝光时间为20min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程是Y=-3.2204x+37.73,R2=0.9955,最低可检出6.39×102拷贝/反应体系的Psa-V;检测限为2.38×102拷贝/μL反应体系;应用人工染菌后的枝条样品检测,则最低检出限是6.30×104 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符。3.基于RT-PCR的Psa-V活菌检测应用RT-PCR技术,建立陕西猕猴桃产区Psa-V活菌检测方法。结果表明,RT-PCR法可有效检测出Psa-V活菌,在纯培养物中,最小检出限为1.26×104拷贝/μL反应体系;对于染菌花粉样品,增菌12h,灵敏度可达1.39×101 CFU/g。
（猕猴桃花粉）
（猕猴桃雄花粉）
